B细胞克隆技术用于cGAS单克隆抗体的筛选

论文摘要

cGAS是环磷酸鸟苷-腺苷合酶,是一种主要的DNA感受器。dsDNA在胞质中被机体视为一种潜在的危险,当胞质中存在dsDNA时,dsDNA将会与cGAS结合从而激活cGAS的酶活性,利用ATP和GTP合成cGAMP,cGAMP作为第二信使激活cGAS-STING这条免疫通路,诱导细胞核启动Ⅰ型干扰素和其他细胞因子基因的转录,从而在胞质中表达出Ⅰ型干扰素和细胞因子来应对病原微生物的侵染。研究cGAS需要有高效价的抗体,而市面上的cGAS抗体价格昂贵,效果不够理想,无法满足日常科研及应用的要求。本研究以人源cGAS（aa 161-522）蛋白为模式抗原,以该蛋白作为免疫原免疫新西兰公兔。通过分离新西兰公兔的新鲜血液,得到PBMC。通过流式细胞术分离出能够产生识别人源cGAS（aa 161-522）蛋白的B细胞。利用B细胞克隆技术将B细胞中能够识别人源cGAS（aa 161-522）蛋白抗体的重链和轻链可变区基因克隆出来,重组兔抗人cGAS抗体的表达载体并进行鉴定,最后在真核系统中表达兔抗人cGAS单克隆抗体,并检测抗体效价。抗体是机体受到抗原刺激以后,由B淋巴细胞增值分化成浆细胞后所分泌的一种能够识别抗原的糖蛋白,它是体液免疫当中的一种重要的效应分子。抗体主要包括单克隆抗体和多克隆抗体,单克隆抗体是针对专一的抗原决定簇产生的抗体,单克隆抗体特异性强、灵敏度高。市面上最为常见的抗体是鼠单克隆抗体和兔单克隆抗体,兔单克隆抗体在亲和力和特异性方面优于鼠单克隆抗体,所以兔单克隆抗体在研究和医疗领域占据越来越重要的角色。最为常见的单克隆抗体制备的方法是杂交瘤技术制备单克隆抗体,但是这种方法制备单克隆抗体周期长,筛选抗体效率低。而基于单细胞克隆的新一代单克隆抗体开发技术克服了杂交瘤细胞制备抗体的劣势,利用这种方法制备单克隆抗体能够高效、快速筛选出所需要的抗体。这种方法可利用流式细胞术筛选能产生特异性抗体的B细胞,通过B细胞克隆技术将B细胞中的抗体重链和轻链的基因克隆出来,通过重组抗体表达载体并进行表达和鉴定,最后筛选出能够识别特定抗原的兔单克隆抗体,再通过真核系统表达单克隆抗体。本研究主要有三个创新点,第一是为了提高B细胞的筛选效率,将人源cGAS（aa 161-522）蛋白与Dylight 650 Antibody Labeling进行偶联,增加对B细胞筛选的特异性,同时进行三次重复筛选,使B细胞的阳性率提高10倍。第二是为了增加B细胞抗体重链和轻链可变区基因的克隆效率,采用了巢式PCR的技术,使抗体基因的调取成功率达95%以上。第三是为了增加抗体的表达产量,采用Expi293Epression System系统代替293T细胞表达系统来表达抗体,其抗体产量比用293T细胞表达抗体提高了20倍本研究最终筛选到了五株有效的兔抗人cGAS单克隆抗体,其中效价OD值可达2.5以上。通过对兔抗人cGAS单克隆抗体的制备,本研究建立了基于单克隆B细胞的兔单克隆抗体筛选方法,该方法的建立为后期制备具有治疗性单克隆抗体奠定了基础。在制备兔抗人的cGAS单克隆抗体的同时也利用实验兔的血清制备兔抗人的cGAS多克隆抗体。

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 第一章 绪论
•   1.1 兔单克隆抗体的发展及应用
•     1.1.1 兔单克隆抗体的制备方法
•     1.1.2 兔单克隆抗体的优势
•     1.1.3 兔单克隆抗体的应用
•   1.2 cGAS研究的进展
•     1.2.1 cGAS的发现
•     1.2.2 cGAS作为DNA感受器的作用机制
•     1.2.3 cGAS的功能
•   1.3 研究目的及意义
• 第二章 人源c GAS（aa161-522）蛋白的原核诱导表达
•   2.1 材料
•   2.2 方法
•     2.2.1 PET-SUMO-cGAS（aa161-522）表达菌株的构建
•     2.2.2 cGAS（aa161-522）蛋白的原核诱导表达
•     2.2.3 cGAS（aa161-522）蛋白的提取和纯化
•     2.2.4 cGAS（aa161-522）蛋白的SDS-PAGE鉴定
•     2.2.5 cGAS（aa161-522）蛋白的生物活性鉴定
•   2.3 实验结果
•     2.3.1 cGAS（aa161-522）蛋白的SDS-PAGE鉴定结果
•     2.3.2 cGAS（aa161-522）蛋白生物活性鉴定结果
•   2.4 讨论
• 第三章 兔抗人c GAS抗体的制备
•   3.1 材料
•   3.2 方法
•     3.2.1 实验兔的免疫
•     3.2.2 B细胞的分选
•     3.2.3 B细胞的培养及鉴定
•     3.2.4 单克隆抗体表达载体的构建和初筛
•     3.2.5 单克隆抗体的表达及鉴定
•     3.2.6 兔抗人c GAS多克隆抗体的制备
•   3.3 实验结果
•     3.3.1 实验兔血清抗体效价鉴定
•     3.3.2 B细胞的分选结果
•     3.3.3 B细胞上清抗体效价鉴定
•     3.3.4 抗体可变区基因的调取和质粒双酶切结果
•     3.3.5 重组抗体表达载体测序比对结果
•     3.3.6 兔抗人c GAS单克隆抗体的初筛
•     3.3.7 Expi293 Expression System细胞上清抗体效价鉴定
•     3.3.8 兔抗人c GAS单克隆抗体的鉴定
•     3.3.9 兔抗人c GAS多克隆抗体的鉴定
•   3.4 讨论
• 第四章 结论
• 附录1
• 附录2
• 参考文献
• 攻读学位期间承担的科研任务与主要成果
• 致谢
• 索引
• 个人简历

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 陈苏星

导师: 陈骐

关键词: 单克隆抗体,细胞单克隆技术,抗体制备

来源: 福建师范大学

年度: 2019

分类: 基础科学

专业: 生物学

单位: 福建师范大学

分类号: Q813.2

DOI: 10.27019/d.cnki.gfjsu.2019.001865

总页数: 92

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