紫色硫细菌Marichromatium gracile YL28对海水养殖水体氮污染的生物修复

论文摘要

在近海养殖水域,氨氮（NH4+）、亚硝氮（NO2-）和硝氮（NO3-）含量普遍超标,多年来一直排在众多污染物首位,这不但制约了水产养殖业的发展,也对沿海或近海生态环境形成潜在威胁。微生物修复技术是一种直接有效的手段,已在养殖水体有害污染物（如氨氮和亚硝氮）的去除、调节养殖生态系统等方面发挥了重要作用。然而,目前研究和应用的微生物主要源自土壤或淡水环境,源于海洋的物种鲜有报道,而且这些陆源或淡水微生物在复杂海水养殖水体或海洋等高盐环境中究竟能否存活并发挥生物活性,尚无明确定论。现有研究表明,微生物普遍具有氨化作用,能将有机氮化物转化为氨并释放到环境中,但在目前,关于这方面研究的菌株很少。已有文献表明,很多菌株在有机氮源环境中对水体氨氮去除的能力大幅度降低,甚至完全抑制。养殖水体沉积物-水界面（Sediment-Water Interface,SWI）是一个营养物质丰富、微生物代谢活跃的生态环境,但该区域溶氧和光照往往不足,导致营养物质不能完全降解,产生的多种可溶性小分子物质（如无机氮、氨基酸、肽、有机酸、醇和糖等）释放于水体,这被认为是水体富营养化或恶化的主要源头。因此,针对性开发适应海水养殖水体的微生物修复剂,尤其是适应SWI这种低光、低氧甚至无氧的、营养丰富且复杂环境的新型高效脱氮微生物制剂,对水产养殖业和海洋环境的健康持续发展具有重要意义。本课题组在前期研究中自红树林潮间带分离获得一株能够以亚硝氮为唯一氮源生长、高效去除水体中高浓度无机三态氮（氨氮、亚硝氮和硝氮）的紫色硫细菌YL28,被鉴定为Marichromatium gracile,是迄今发现的亚硝氮去除能力最高的不产氧光合细菌（Anoxygenic Phototrophic Bacteria,APB）菌株之一。研究初步阐明了该菌株生长、脱氮特性的基本规律和高效脱氮的分子机制,但在有机氮环境中,该菌株氨氮去除能力受到严重影响。鉴于此,本研究以YL28为研究对象,通过复壮筛选的方法,筛选到了在蛋白胨和尿素存在时具有高效氨氮去除能力的菌株,并优化了该菌株的培养条件。随后在高浓度无机三态氮共存的评价系统中,选择了光、氧和环境中可能存在的不同结构类型的碳源、氮源等影响因子,考察了该菌株对环境（尤其是海水养殖水体SWI）的适应性。进一步采用16S rRNA（V3-V4）高通量测序、qPCR方法,并结合水体理化指标,深入研究了该菌株对养殖系统沉积物细菌群落结构的影响,以及对氮代谢相关功能基因（nifH、amo A、narG和nosZ）的调控作用。主要研究结果如下:1)针对有机氮限制微生物去除无机三态氮能力的问题,本研究采用复壮筛选的方法,获得了一株在有机氮化物存在条件下能够高效去除氨氮的YL28菌株,与出发株相比,氨氮去除率可提高90%以上。针对该菌株在培养和制剂存储过程中,易沉淀分层的问题,在原有培养基基础上,采用单因子优化法,获得了优化培养基配方。与优化前相比,菌体生物量(OD660)提高了54.20%,BChl和Car合成量分别提高了50.73%和52.69%。液体制剂黑暗静置储存810 d,沉降率仍可达到55%以上,且氨氮去除率在整个储存周期均达到80%以上。2)针对海水养殖水体环境的复杂性,本研究在无机三态氮体系中,选取17种有机碳化物及其复合物、2种有机氮化物和养殖饵料等考察了该菌株对环境因素的适应性。研究发现,小分子有机碳（乙酸和丙酮酸等）是YL28生长和脱氮的良好碳源;海藻寡糖并不是良好的碳源,但海藻寡糖与良好碳源复合能够显著促进该菌株的生长和脱氮活性;难以利用的碳源（卡拉胶、海藻酸钠和环糊精等）与良好碳源复合,其生长和脱氮活性未受到明显影响。有机氮化物与良好碳源复合,不影响菌株对无机三态氮去除能力,但显著影响菌株的生长特性。3)光和氧是影响APB生长代谢的重要因素。本研究通过单因子试验和响应面优化分析,阐明了光、氧与YL28生长和脱氮变化相互关系,获得了理论最佳的溶氧（用装样量表示）、光照强度和光周期条件,并采用期望分析获得了实际应用中可行的光氧参数范围。研究发现,光照厌氧时,该菌株能够进行良好生长和脱氮;光照好氧时,菌株生长活性降低,但脱氮活性没有显著变化。黑暗厌氧条件下,菌株仍能够保持较好的脱氮能力,无机三态氮的转化率达到81.41%。通过响应面优化,在优化培养基的基础上,菌体生物量(OD660)提高了21.28%,氨氮去除率达到93.79%。4)养殖生态系统的微生物群落特征变化及其定向调控是反映养殖水体健康水平的重要指标之一。本研究采用16S rRNA（V3-V4）高通量测序技术分析了YL28对南美白对虾海水养殖水体中细菌群落结构变化及其多样性的影响。研究发现,该菌株能够显著改善南美白对虾海水养殖水体水质并达到渔业水质标准（GB11607-89）Ⅰ类水质要求,也能定植于海水养殖系统中调节细菌群落结构。添加该菌株,能够显著提高沉积物细菌群落多样性,也能够显著提高变形菌门（Proteobacteria）、γ-变形菌纲（Gammaproteobacteria）、着色菌目（Chromatiales）、着色菌科（Chromatiaceae）、海洋着色菌属（Marichromatium）的物种丰度,但不改变其在分类水平上优势物种类群的地位。海命菌属（Marivita）和OM27类群可作为水生生态系统健康状况的潜在指标,且OM27和Marichromatium之间存在共生关系。另外,该菌株能够有效的降低条件致病菌（Vibrio）的丰度和种类,抑制率达到62%以上。5)为揭示该菌株与氮代谢循环相关微生物的相互作用关系,采用qPCR法定量分析了氨氧化细菌（AOB）、氨氧化古菌（AOA）16S rRNA和氮代谢相关功能基因的丰度变化（如固氮（nifH）、硝化（amoA）和反硝化（narG和nos Z））。研究发现,YL28不影响环境中AOA的丰度变化,但能够显著促进AOB丰度升高,相比于高剂量的YL28,低剂量的YL28更有利于提高AOB的丰度。YL28与nifH丰度具有显著地正相关关系,高剂量添加YL28可提高amoA丰度,YL28不影响nar G和nosZ丰度变化。最后在上述研究结论的基础上建议在南美白对虾海水养殖水体中,该菌株的使用周期以5 d（低剂量）或10-12 d（高剂量）最佳。综上所述,针对微生物普遍具有氨化作用,在有机氮素环境中释氨,严重影响微生物脱氮这一问题,本研究筛选获得了一株在该环境中能够高效去除无机三态氮的菌株YL28并优化了该菌株的培养条件,系统的考察了环境因素（碳源、氮源、光和氧等）对该菌株生长和脱氮活性的影响,研究了该菌株对养殖水体沉积物细菌群落结构的影响,阐明了该菌株对水体环境的适应性规律和特点。研究发现海藻寡糖能够显著促进该菌株的生物活性、明显改善菌体培养和储存过程中的聚集沉降,为海藻寡糖的应用提出了一种新途径。在黑暗厌氧环境中,该菌株依然能够保持良好的生长和脱氮能力,能够在沉积物-水界面环境中定植并良好的适应这种复杂环境,从养殖水体污染物源头有效地控制氨氮和亚硝氮等有害物质的释放。本研究对于针对性地研究APB水质调节剂,为微生物制剂的合理开发与应用提供参考。

论文目录

• 摘要
• abstract
• 缩略词中英文对照表
• 第1章 绪论
•   1.1 氮代谢循环研究进展
•     1.1.1 氮代谢主要途径及其特性
•     1.1.2 海洋氮循环研究进展
•   1.2 海水养殖水体氮污染现状
•     1.2.1 世界海水养殖资源的分布
•     1.2.2 我国海水养殖资源现状
•     1.2.3 海水养殖水体污染物来源与危害
•     1.2.4 海水养殖水体无机氮化物的治理方法
•   1.3 水产养殖业微生物调节剂研究进展
•     1.3.1 淡水微生物调节剂在海水应用的局限性
•     1.3.2 海洋微生物调节剂的发展现状
•     1.3.3 微生物调节剂的效价评定
•   1.4 不产氧光合细菌在水产养殖业的研究动态
•     1.4.1 不产氧光合细菌研究进展
•     1.4.2 不产氧光合细菌与环境因子的响应
•     1.4.3 不产氧光合细菌在水产养殖业的应用
•   1.5 课题研究思路及主要研究内容
• 第2章 紫色硫细菌YL28脱氮稳定性研究
•   2.1 引言
•   2.2 材料与方法
•     2.2.1 材料
•     2.2.2 体系设置
•     2.2.3 方法
•   2.3 结果与分析
•     2.3.1 M.gracile YL28基因组测序分析
•     2.3.2 培养基组分优化
•     2.3.3 沉降特性分析
•     2.3.4 生物活性稳定性分析
•   2.4 讨论
• 第3章 环境有机物对紫色硫细菌YL28脱氮特性研究
•   3.1 引言
•   3.2 材料与方法
•     3.2.1 材料
•     3.2.2 体系设置
•     3.2.3 方法
•   3.3 结果与分析
•     3.3.1 有机碳化物适应性分析
•     3.3.2 有机碳化物对无机氮去除特性分析
•     3.3.3 有机氮化物对无机氮去除特性分析
•     3.3.4 养殖饵料对细胞生长和无机氮的去除
•     3.3.5 流加亚硝酸盐对细胞生长和无机氮的去除
•   3.4 讨论
• 第4章 环境光、氧因子对紫色硫细菌YL28脱氮特性研究
•   4.1 引言
•   4.2 材料与方法
•     4.2.1 材料
•     4.2.2 体系设置
•     4.2.3 方法
•   4.3 结果与分析
•     4.3.1 光照强度对M.gracile YL28氮转化过程的影响
•     4.3.2 光照强度对菌体光合色素合成的影响
•     4.3.3 光周期对M.gracile YL28生长和脱氮特性的影响
•     4.3.4 装样量对唯一氮源体系氮转化能力分析
•     4.3.5 装样量对M.gracile YL28脱氮和细菌光合色素合成的影响
•     4.3.6 响应面法分析微生物调节剂脱氮特性
•   4.4 讨论
• 第5章 基于高通量测序分析法揭示紫色硫细菌YL28对海水养殖水体群落结构的影响
•   5.1 引言
•   5.2 材料与方法
•     5.2.1 材料
•     5.2.2 研究体系构建和管理
•     5.2.3 方法
•     5.2.4 序列分析
•   5.3 结果与分析
•     5.3.1 沉积物与上覆水体理化性质
•     5.3.2 沉积物样本差异性分析
•     5.3.3 细菌群落结构的Chao1和Shannon指数分析
•     5.3.4 细菌群落结构的PCA、PCoA和nMDS分析
•     5.3.5 环境因子、样本与细菌群落间的相互作用关系
•     5.3.6 各分类水平上优势菌群及弧菌的变化
•     5.3.7 物种系统进化关系及差异显著物种丰度变化分析
•     5.3.8 基于OTUs序列的物种进化关系分析
•   5.4 讨论
• 第6章 基于16SrRNA的细菌功能预测与氮代谢相关功能基因定量分析
•   6.1 引言
•   6.2 材料与方法
•     6.2.1 材料
•     6.2.2 研究体系构建和管理
•     6.2.3 方法
•   6.3 结果与分析
•     6.3.1 环境中细菌功能预测分析
•     6.3.2 基于OTUs序列的氮代谢相关物种进化关系分析
•     6.3.3 模式菌株氮代谢相关基因统计
•     6.3.4 氨氧化细菌（AOB）和氨氧化古菌（AOA）定量分析
•     6.3.5 AOB氮代谢功能基因定量分析
•   6.4 讨论
• 第7章 结论与展望
•   7.1 结论
•   7.2 展望
• 参考文献
• 致谢
• 个人简历、在学期间发表的学术论文和研究成果

文章来源

类型: 博士论文

作者: 张晓波

导师: 杨素萍

关键词: 紫色硫细菌,生物修复,细菌群落结构,功能基因

来源: 华侨大学

年度: 2019

分类: 基础科学,工程科技Ⅰ辑

专业: 生物学,环境科学与资源利用,环境科学与资源利用

单位: 华侨大学

分类号: X714;X172

总页数: 157

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