糖苷酶 BglSK和BglSp的原核表达及转化人参皂苷Compound K的研究

论文摘要

人参皂苷（Ginsenoside）是人参（Panax ginseng C.A.Mey）的主要活性物质,具有抗肿瘤,调节机体免疫力,延缓衰老等药用开发和保健价值,尤其稀有人参皂苷Compound K（CK）、Rh2和Rg3等在疾病治疗方面具有更高的疗效,但是稀有人参皂苷在人参中含量极低,缺乏广泛且稳定来源,因此,如何大量获取稀有人参皂苷是目前科学研究领域的研究热点之一。由于,稀有人参皂苷与大量人参皂苷相比,其皂苷元相同,只是糖基化修饰数目相对较少,所以,将含有较多糖基修饰的大量人参皂苷的糖基水解,就能制备含有较少糖基修饰的稀有人参皂苷。生物来源的糖苷酶可以特异性水解糖苷或糖蛋白等含糖类化合物中的糖苷键,其具有来源广泛、反应条件温和、特异性高、副产物含量和种类较少等优势,可应用于人参皂苷的转化。本研究通过原核表达的方式制备了大量的糖苷酶BglSK（来源于科氏血杆菌Sanguibacter keddieii）和BglSp（来源于鞘氨醇单胞菌Sphingomonas sp.2F2）,并对其反应条件进行优化,构建了将大量人参皂苷Rb1、Rb2、Rc和Rd转化为稀有人参皂苷CK的体系,具体结果如下:1.糖苷酶BglSK和BglSp的原核表达糖苷酶BglSK和BglSp基因序列的密码子优化和基因合成后,分别构建在pET32a、pET14b和pCold-SUMO三种不同的原核表达载体中,筛选出可溶性表达最好的原核表达载体pET14b-BglSK和pCold-SUMO-BglSp。2.糖苷酶BglSK和BglSp的粗酶酶活验证以大量人参皂苷单体Rb1、Rb2、Rc和Rd为底物,初步鉴定糖苷酶BglSK和BglSp水解人参皂苷的活性,发现糖苷酶BglSK可以将Rb1→GypLXXV/CK、Rb2→C-Y、Rc→C-Mc、Rd→F2/CK;糖苷酶 BglSp 水解途径为:Rb1→GypXVII、Rb2→C-O、Rc→C-Mc1、Rd→F2。3.糖苷酶BglSK和BglSp原核表达诱导条件优化糖苷酶BglSK和BglSp的最佳诱导表达条件均为15℃、0.1 mM IPTG浓度,并使用AKTA蛋白纯化系统纯化出10.77 mg糖苷酶BglSK和7.88 mg糖苷酶BglSp。4.糖苷酶BglSK和BglSp酶性质的研究糖苷酶BglSK和BglSp的最适反应温度范围为35-40℃,最适反应pH范围是7.5-8.5;检测了不同离子浓度对酶活性的影响,发现当离子浓度高于10 mM时,均会抑制酶反应活性。5.糖苷酶BglSK和BglSp的催化途径解析以大量人参皂苷单体Rb1、Rb2、Rc和Rd为底物,鉴定糖苷酶水解特异性。鉴定糖苷酶BglSK具有C-3位外切、内切活性,C-20位Glc外切活性,水解途径为:Rb1→GypXVII→GypLXXV→CK、Rb2→C-O→C-Y、Rc→C-Mc1→C-Mc、Rd→F2→CK;糖苷酶BglSp具有C-3位外切活性和C-20位外切活性,水解途径为:Rb1→GypXVII→F2、Rb2→C-O→F2、Rc→C-Mc1→Rd→F2。6.糖苷酶BglSK和BglSp转化人参总皂苷为CK体系的建立使用糖苷酶BglSK单酶转化与糖苷酶BglSK和BglSp双酶组合转化的2种方式将人参总皂苷中的大量人参皂苷转化为稀有人参皂苷CK,糖苷酶BglSK单酶转化时,大量人参皂苷Rb1、Rb2、Rc和Rd的摩尔转化率为65.64%,双酶组合时,大量人参皂苷Rbi、Rb2、Rc和Rd的摩尔转化率高达88.00%,相对于单酶转化摩尔转化率提高了22.36%。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 1 绪论
•   1.1 人参皂苷概述
•     1.1.1 人参皂苷的分类与生物合成途径
•     1.1.2 常见人参皂苷的药理活性
•   1.2 人参皂苷的转化
•     1.2.1 物理转化法
•     1.2.2 化学转化法
•     1.2.3 生物转化法
•   1.3 糖苷酶的研究进展
•     1.3.1 糖苷酶
•     1.3.2 糖苷酶的催化机制
•     1.3.3 糖苷酶的应用
•   1.4 本课题研究的目的与意义
• 2 糖苷酶BglSK和BglSP的原核表达及粗酶功能验证
•   2.1 引言
•   2.2 材料与试剂
•     2.2.1 材料
•     2.2.2 试剂与仪器
•   2.3 实验方法
•     2.3.1 糖苷酶BglSK和BglSp基因序列查询与密码子优化
•     2.3.2 糖苷酶BglSK和BglSp的原核表达载体构建
•     2.3.3 糖苷酶BglSK和BglSp的原核表达
•     2.3.4 糖苷酶BglSK和BglSp粗酶功能验证
•   2.4 结果与分析
•     2.4.1 糖苷酶BglSK和BglSp基因序列分析
•     2.4.2 糖苷酶BglSK和BglSp原核表达载体的构建
•     2.4.3 糖苷酶BglSK和BglSp的原核表达
•     2.4.4 糖苷酶BglSK和BglSp粗酶功能验证
•   2.5 讨论
•   2.6 本章小结
• 3 糖苷酶BglSK和BglSp原核表达诱导条件优化及最适反应条件优化
•   3.1 引言
•   3.2 材料与试剂
•     3.2.1 材料
•     3.2.2 试剂与仪器
•   3.3 实验方法
•     3.3.1 糖苷酶BglSK和BglSp的蛋白诱导表达条件优化
•     3.3.2 糖苷酶BolSK和BglSp的蛋白纯化
•     3.3.3 糖苷酶BglSK和BglSp最适反应温度及pH测定
•     3.3.4 糖苷酶BalSK和BglSp温度及pH稳定性的测定
•     3.3.5 不同离子浓度对糖苷酶BglSK和BglSp相对酶活的影响
•   3.4 结果与分析
•     3.4.1 糖苷酶BglSK和BglSp的蛋白诱导表达条件优化
•     3.4.2 糖苷酶BglSK和BglSp的蛋白纯化
•     3.4.3 糖苷酶BglSK和BglSp最适反应温度及pH
•     3.4.4 糖苷酶BglSK和BglSp温度稳定性和pH稳定性
•     3.4.5 不同离子浓度对糖苷酶BglSK和BglSp相对酶活的影响
•   3.5 讨论
•   3.6 本章小结
• 4 糖苷酶BglSK和BglSp催化途径解析及转化人参总皂苷为CK体系的建立
•   4.1 引言
•   4.2 材料与试剂
•     4.2.1 材料
•     4.2.2 试剂与仪器
•   4.3 实验方法
•     4.3.1 糖苷酶BglSK和BglSp的催化途径解析
•     4.3.2 人参总皂苷的制备
•     4.3.3 糖苷酶BglSK和BglSp转化人参总皂苷为CK体系的建立
•   4.4 结果与分析
•     4.4.1 糖苷酶BglSK和BglSp的催化途径解析
•     4.4.2 人参总皂苷的提取结果
•     4.4.3 糖苷酶BglSK和BglSp转化人参总皂苷为CK体系的建立
•   4.5 讨论
•   4.6 本章小结
• 结论
• 参考文献
• 附录
• 攻读学位期间发表的学术论文
• 致谢

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 尹雪

导师: 李玉花,王宇

关键词: 稀有人参皂苷,人参皂苷转化,糖基水解,糖苷酶

来源: 东北林业大学

年度: 2019

分类: 基础科学,工程科技Ⅰ辑

专业: 生物学,有机化工

单位: 东北林业大学

分类号: TQ464;Q814

DOI: 10.27009/d.cnki.gdblu.2019.000271

总页数: 73

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