耐热新城疫病毒载体的构建及其在H9N2亚型禽流感疫苗研制中的应用

论文摘要

禽流感（Avian Influenza,AI）和新城疫（Newcastle Disease,ND）是两类严重危害养禽业的动物重要传染病,它们的病原分别是禽流感病毒（Avian Influenza Virus,AIV）和新城疫病毒（Newcastle Disease Virus,NDV）。对这两种疫病的预防和控制,疫苗接种仍是主要手段。H9N2亚型AIV属于低致病型病毒,在感染鸡群后,仅引起轻微的呼吸道症状和产蛋率下降,但与其它病原混合感染时会产生致病协同作用,从而造成较高的死亡率。H9N2亚型AI在我国流行的20多年期间,给我国养禽业造成了巨大的危害。NDV是单股负链RNA病毒,在反向遗传学技术的推动下,用其作为外源基因表达载体的研究迅速发展,研究证明,NDV作为外源基因表达载体构建的活载体疫苗,可以诱导动物的体液免疫和细胞免疫,可以在动物体内增殖并长期表达抗原基因,也不与宿主基因组整合,安全高效。本研究在实验室前期建立的新型耐热NDV弱毒株反向遗传学平台NDV-rAHR09的基础上,构建一种热稳定的基因VIII型NDV弱毒株外源基因表达载体,进一步利用该载体表达H9亚型AIV的血凝素（Hemagglutinin,HA）基因,创制热稳定的H9亚型AIV重组疫苗候选株,并对其免疫效力进行评价。1.热稳定的基因VIII型新城疫弱毒株外源基因表达载体的构建以热稳定的NDV-rAHR09反向遗传平台为基础,在已构建的全长重组质粒P和M基因间隔区引入酶切位点PmeI,作为外源基因插入位点,构建了 rAHR09-P表达载体。通过无缝克隆的方法插入EGFP报告基因,构建了 p-rAHR09-EGFP-l转录载体,经拯救获得能够稳定表达EGFP基因的重组病毒NDV-rAHR09-EGFP-l。经测定,该重组病毒生长特性、热稳定性和毒力等与亲本弱毒株相比均无显著变化。2.表达H9亚型禽流感病毒HA基因的耐热重组新城疫病毒的构建本研究构建了三种形式的重组病毒,分别为rAHR09-H9HA-O、rAHR09-H9HA-Q、rAHR09-H9HA-T。重组病毒 rAHR09-H9HA-O 表达了 H9N2 亚型 AIV 毒株 YZ1406 的 HA蛋白,重组病毒rAHR09-H9HA-Q表达的HA蛋白缺失了跨膜区,重组病毒rAHR09-H9H A-T表达的HA蛋白替换了 NDVF蛋白的跨膜区。3株重组病毒在鸡胚上均能够稳定生长,血凝滴度能达到28以上。在鸡胚上连续传15代后,对其耐热性进行测定,结果显示:3株重组病毒均有较好的热稳定性,经56℃处理90 min以上仍有血凝活性。3株获救的重组病毒MDT值均大于120h,ICPI指数均小于亲本病毒,经与原NDV弱毒株比较,证I明外源基因的插入没有影响重组病毒的毒力。3.3种重组病毒疫苗候选株免疫效力评价75只7日龄SPF鸡随机平均分成5组,分别为3个重组病毒免疫组、新城疫-禽流感二联灭活苗免疫组和非免疫对照组。重组病毒免疫采用滴鼻点眼的方式,免疫剂量为106 EID50;灭活苗免疫采用肌肉注射的方式,免疫剂量为0.2 mL。免疫21天后,以滴鼻点眼的方式进行攻毒,攻毒毒株为H9亚型AIV（YZ1406株）,剂量为108EID50。免疫后第7、14、21、28天测定各组实验鸡血清中H9的抗体效价。结果表明,重组病毒组在接种后抗体水平持续上升且始终高于灭活疫苗组,其中重组病毒rAHR09-H9HA-T免疫后21 d产生的抗体效价最高达到24。攻毒后3、6、9天采集喉头和泄殖腔拭子,用荧光定量PCR的方法测定其病毒含量。结果表明,重组病毒rAHR09-H9HA-O、rAHR09-H9HA-T与灭活苗均能有效降低排毒量,重组病毒rAHR09-H9HA-T组排毒量最低。综上所述,本研究构建了能够稳定表达外源基因的新型耐热NDV载体rAHR09-P,并在此基础上构建了 3株表达H9亚型AIV HA蛋白的重组病毒,其中重组病毒rAHR09-H9HA-T在动物实验中展现了良好的免疫保护效果,具有作为防控H9亚型禽流感重组活疫苗的潜力。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 缩略词表
• 文献综述
•   1 NDV的病原学特性
•     1.1 NDV的分类
•     1.2 NDV的基因组特征
•     1.3 NDV转录特点
•   2 NDV耐热性及其分子基础
•   3 新城疫病毒反向遗传操作系统
•     3.1 NDV反向遗传操作系统建立
•     3.2 反向遗传技术与NDV毒力研究
•   4 NDV作为外源基因表达载体的研究
•     4.1 NDV作为外源基因表达载体插入位点、方式及容载量的研究
•     4.2 新城疫病毒作为外源基因表达载体的应用
•       4.2.1 在动物疫苗研究中的应用
•       4.2.2 在人类疾病相关疫苗研究方面的应用
•     4.3 以新城疫病毒为载体表达多个外源基因的研究
•   5 本研究的目的与意义
• 第一章 一种热稳定的基因Ⅷ型新城疫弱毒株外源基因表达载体的构建
•   1 材料
•     1.1 细胞及鸡胚
•     1.2 菌株及质粒
•     1.3 主要试剂
•       1.3.1 分子生物学试剂
•       1.3.2 化学试剂
•     1.4 主要仪器设备
•     1.5 分子生物学软件
•   2 方法
•     2.1 外源基因插入位点的引入
•       2.1.1 突变引物设计
•       2.1.2 PCR扩增
•       2.1.3 PCR产物的转化及鉴定
•     2.2 表达载体RAHR09-P的构建
•       2.2.1 中间质粒T2-R123的构建
•       2.2.2 含Pme Ⅰ酶切位点片段的替换
•   3 表达EGFP蛋白的重组新城疫病毒的构建
•     3.1 EGFP基因的克隆与鉴定
•       3.1.1 引物设计与合成
•       3.1.2 EGFP基因的扩增
•     3.2 全长重组质粒P-RAHR09-EGFP-1的构建及鉴定
•       3.2.1 全长重组质粒p-rAHR09-EGFP-1的构建
•       3.2.2 全长重组质粒p-rAHR09-EGFP-1的鉴定
•     3.3 重组病毒的拯救与鉴定
•       3.3.1 细胞和转染用质粒提取
•       3.3.2 重组质粒和辅助质粒共转染
•       3.3.3 重组病毒的鉴定
•       3.3.4 重组病毒耐热性测定
•       3.3.5 重组病毒NDV-rAHR09-EGFP-1生物学特性的测定
•   4 结果
•     4.1 EGFP基因PCR扩增结果
•     4.2 全长质粒P-RAHR09-EGFP-1 PCR鉴定结果
•     4.3 全长质粒P-RAHR09-EGFP-1酶切鉴定结果
•     4.4 辅助质粒鉴定结果
•     4.5 获救重组病毒HA和HI测定结果
•     4.6 获救重组病毒测序验证结果
•     4.7 获救重组病毒EGFP基因表达的鉴定结果
•     4.8 获救重组病毒耐热性测定结果
•     4.9 获救重组病毒生物学特性的测定结果
•   5 讨论
• 第二章 以耐热新城疫弱毒为载体的H9N2亚型禽流感活疫苗的研制
•   1 材料
•     1.1 毒株
•     1.2 菌株及质粒
•     1.3 细胞、鸡胚及实验室动物
•     1.4 主要试剂
•     1.5 分子生物学软件
•     1.6 主要仪器设备
•     1.7 配制试剂
•   2 方法
•     2.1 HA基因的克隆
•       2.1.1 HA基因ORF扩增引物的设计
•       2.1.2 缺失跨膜区序列的HA基因扩增引物的设计
•       2.1.3 包含NDV F蛋白跨膜区序列的HA基因扩增引物的设计
•     2.2 全长重组质粒P-RAHR09-H9HA-O、P-RAHR09-H9HA-T、P-RAHR09-H9-Q的构建及鉴定
•       2.2.1 全长重组质粒的构建
•       2.2.2 全长重组质粒的酶切鉴定
•     2.3 重组病毒的拯救及鉴定
•       2.3.1 重组病毒的拯救
•       2.3.2 3株获救重组病毒的鉴定
•     2.4 重组病毒生物学特性的研究
• 50)的测定'>      2.4.1 重组病毒的鸡胚半数感染量(EID₅₀)的测定
•       2.4.2 重组病毒生长曲线的测定
•       2.4.3 ICPI的测定
•       2.4.4 MDT的测定
•       2.4.5 重组病毒耐热性测定
•   3 重组病毒免疫效力评价
•     3.1 重组病毒免疫保护试验
•     3.2 HI抗体水平监测
•     3.3 攻毒后排毒率的检测
•   4 结果
•     4.1 全长重组质粒酶切鉴定结果
•     4.2 重组病毒拯救鉴定结果
•     4.3 IFA鉴定结果
•     4.4 WESTERN-BLOT鉴定结果
•     4.5 3株重组病毒生物学特性鉴定结果
•       4.5.1 重组病毒的生长曲线
•       4.5.2 重组病毒EID50、MDT及ICPI测定结果
•     4.6 重组病毒耐热性测定结果
•     4.7 HI抗体效价测定结果
•     4.8 攻毒后排毒情况
•   5 讨论
• 全文总结
• 参考文献
• 致谢
• 攻读学位期间取得的学术成果

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 陈银

导师: 曹永忠

关键词: 新城疫病毒,亚型禽流感病毒,重组活疫苗,热稳定,免疫效力

来源: 扬州大学

年度: 2019

分类: 基础科学,农业科技

专业: 生物学,畜牧与动物医学

单位: 扬州大学

基金: 国家重点研发计划项目(2016YFD0501604),2016YDF0501609),国家蛋鸡产业技术体系项(CARS-40-K16),扬州大学“高端人才支持计划”(2016年度),江苏高校优势学科建设工程资助项目

分类号: S852.65

DOI: 10.27441/d.cnki.gyzdu.2019.000794

总页数: 62

文件大小: 4396K

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