耐热毛栓菌中热激转录因子HSF2对胞外漆酶活性调节研究

论文摘要

真菌漆酶（EC 1.10.3.2）属于含铜多酚氧化酶家族,是重要的木质纤维素降解酶,能以分子氧作为末端电子受体氧化多种酚类化合物和芳香胺等木质素结构类似物,在生物制浆、食品工业、生物合成、生物能源、生物检测和生物修复等领域应用广泛。在前期的研究中筛选到一株耐热毛栓菌T.trogii S0301,该菌株生长速度快、漆酶产量高和漆酶性质突出等特点,较理想的符合了商业漆酶生产菌株应该具有的漆酶产量高、发酵周期短等特征,具有良好的理论研究和工业应用前景。然而,目前该菌株基因组信息未见报道、遗传转化方法尚未建立,对于该菌株为代表的白腐菌中漆酶同工酶基因表达调控的认识也相当有限。鉴于此,以该菌株为出发材料开展研究,主要结果如下:1、耐热毛栓菌基因组测序及漆酶同工酶家族基因分析在分离获得耐热毛栓菌同核体菌株Trametes trogii homo-19的基础上,利用三代测序技术获得了该菌株的基因组大约220×的clean reads。基因组数据的分析结果表明:基因组大约为39.88 Mb,contig N50大小为2.4 Mb;基因组contig length数为29,最长的contig length长度为4.82 Mb,最短的contig length长度为20,367bp。GC含量的百分比为55.47%;预测到14,508个蛋白质编码基因,其中有542个CAZymes相关基因和9个可能的漆酶基因。并对9个漆酶同工酶基因的基因结构和上游启动子区域的顺式作用元件进行了预测分析,为该菌株中漆酶同工酶基因家族的表达规律及基因资源的利用奠定了研究基础。2、耐热毛栓菌遗传转化体系的构建参考丝状真菌遗传转化方法的报道,为了提高转化率,对转化用出发菌株、酶解液配方、渗透缓冲剂、酶解时间和转化用载体等多个条件进行了优化,最终选择1.5%的溶壁酶,酶解4 h,0.75 M蔗糖浓度,PEG/CaCl2转化方法作为该菌株适宜的条件。基因过量表达的水平依赖于启动子的强度,对出发质粒中启动子进行了优化。在建立转化方法的基础上,克隆了该菌株中三磷酸甘油醛脱氢酶Gpd启动子的不同区段,并构建它们驱动绿色荧光蛋白GFP,转化毛栓菌原生质体,通过检测转化子中GFP荧光强度,筛选得到Gpd-T2可以更好的驱动GFP基因的表达。使用Gpd-T2启动子成功对漆酶同工酶Lac13和Lac53进行了过表达,并使漆酶Lac13和Lac53的过表达转化子的胞外漆酶酶活的分泌时间提前,且比野生型菌株具有更高的漆酶活性。3、耐热毛栓菌中热激转录因子HSF2对胞外漆酶活性的调节分析研究发现,耐热毛栓菌T.trogii homo-19中的HSF2存在可变剪接突变体,根据对转录因子HSF2的基因结构域分析,选取了4个片段。通过遗传转化体系,在菌株T.trogii homo-19中分别过表达了这4个片段。利用潮霉素抗性和潮霉素基因筛选,总共得到了25个片段HSF2-1的过表达转化子;10个片段HSF2-2过表达转化子;40个片段HSF2-3过表达转化子;27个片段HSF2-4过表达转化子。并对片段HSF2-2过表达转化子进行了转录水平的检测,并发现HSF2-2的过表达转化子可以调节胞外总漆酶酶活水平,其中转化子OE-2-20的酶活水平在8天时,相对酶活水平是野生型酶活水平的3倍以上。且可以通过转录水平调节一半以上的漆酶同工酶Lac13（2.12和1.61倍）、Lac2-2（3.14和1.95倍）、Lac2-8（1.94和3.74倍）、Lac1（1.43和3.87倍）、Lac7（1.18和1.14倍）和Lac53（1.42和2.56倍）的漆酶基因转录水平,同时HSF2-2过表达转化子的漆酶在50?C,60?C和70?C的热稳定性也可以证明这一点。综上所述,本研究获得了耐热毛栓菌三代基因组信息并完成了初步的注释,建立了该菌株中功能基因过量表达的方法,完成了对该菌株中漆酶同工酶基因家族的分析,并对该菌株中热激转录因子HSF2参与胞外漆酶活性调节的分子机制进行了初步探索,证明HSF2的过量表达能影响不同漆酶同工酶的表达水平,从而调节胞外漆酶的总活性、漆酶性质和产酶进程,这些研究成果的获得,为在该菌株中开展漆酶等基因的表达调控研究提供了可能,为探索通过转录因子的遗传操作实现白腐菌中漆酶等次生代谢阶段受诱导表达酶类的过量表达和提前表达提供了研究基础,为提高白腐菌漆酶产量、加速产漆酶进程,推动漆酶的产业化应用奠定基础。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 缩略词
• 第一章 引言
•   1.1 真菌漆酶概述
•     1.1.1 真菌漆酶
•     1.1.2 漆酶的结构和催化机理
•     1.1.3 真菌漆酶的应用
•     1.1.4 自然界中真菌漆酶的主要生产者
•     1.1.5 漆酶同工酶基因
•     1.1.6 漆酶的获得
•   1.2 漆酶基因表达调控
•     1.2.1 影响漆酶同工酶表达的因素
•     1.2.2 漆酶启动子序列中响应元件
•     1.2.3 漆酶基因表达调控与转录因子
•     1.2.4 热激转录因子
•     1.2.5 热激转录因子可变剪接亚型
•     1.2.6 不同剪接亚型的生理功能
•   1.3 本课题研究的目的、意义及主要内容
• 第二章 耐热毛栓菌基因组测序及漆酶同工酶家族基因分析
•   2.1 材料与方法
•     2.1.1 菌株
•     2.1.2 试剂
•     2.1.3 培养基
•     2.1.4 DNA提取用菌丝体的获得
•     2.1.5 基因组DNA提取
•     2.1.6 DNA制备、文库构建和基因组测序
•     2.1.7 生物信息学分析方法——基因组的组装和注释
•     2.1.8 漆酶同工酶基因家族生物信息学分析方法
•   2.2 结果与分析
•     2.2.1 基因组数据
•     2.2.2 漆酶同工酶的特征分析
•     2.2.3 漆酶同工酶的结构分析
•     2.2.4 漆酶启动子结构分析
•   2.3 本章小结
• 第三章 耐热毛栓菌遗传转化体系的构建
•   3.1 材料与方法
•     3.1.1 菌株与质粒
•     3.1.2 培养基
•     3.1.3 试剂和溶液
•     3.1.4 实验器具材料
•     3.1.5 原生质体制备、再生和转化方法及优化
•     3.1.6 耐热毛栓菌中启动子优化
•     3.1.7 漆酶同工酶基因lac13和lac53 在耐热毛栓菌菌株中的过量表达
•     3.1.8 敲除方法的探索
•   3.2 结果
•     3.2.1 原生质体优化结果
•     3.2.2 启动子优化结果
•     3.2.3 耐热毛栓菌中漆酶基因lac13和lac53 的过量表达
•     3.2.4 敲除方法的探索
•   3.3 本章小结
• 第四章 耐热毛栓菌中热激转录因子HSF2 的对胞外漆酶活性的调节分析
•   4.1 材料与方法
•     4.1.1 菌株与质粒
•     4.1.2 培养基
•     4.1.3 试剂与器具
•     4.1.4 菌株培养
•     4.1.5 HSF2 中不同区段片段的表达情况
•     4.1.6 HSF2 不同区段过量表达转化子的获得
•     4.1.7 HSF2 过量表达转化子对胞外漆酶活性的影响
•   4.2 结果
•     4.2.1 HSF2 中不同区段片段的表达结果
•     4.2.2 转录因子HSF2中4 个不同区段的片段获得
•     4.2.3 转录因子HSF2中4 个不同区段转化子的获得
•     4.2.4 过表达转化子潮霉素基因检测结果
•     4.2.5 过表达转化子转录水平表达结果
•     4.2.6 HSF2 过表达转化子对胞外漆酶活性的影响
•   4.3 本章小结
• 第五章 结论与展望
•   5.1 结论
•   5.2 展望
• 致谢
• 参考文献
• 攻读硕士研究生期间撰写的论文与专利

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 伍圆圆

导师: 严金平

关键词: 耐热毛栓菌,遗传转化体系,过量表达,热激转录因子

来源: 昆明理工大学

年度: 2019

分类: 基础科学

专业: 生物学

单位: 昆明理工大学

基金: 国家自然科学基金地区项目 (649220150036): 热激转录因子 Hsf1 调控耐热毛栓菌中漆酶基因表达的分子机制,西部之光人才培养项目(331810975801): 高温厌氧菌的代谢工程改造及乙醇定向转化研究

分类号: Q55

DOI: 10.27200/d.cnki.gkmlu.2019.001858

总页数: 122

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