高产丁二酮菌株的筛选、产香特性及功能基因的表达研究

论文摘要

随着人们对自然、健康的追求,风味的内源产生成为食品产业发展的潮流,丁二酮是对奶香风味起到突出贡献的化合物。由于高产丁二酮乳酸菌稀少而且乳酸菌的代谢途径尚不明确,通过内源产生的方式还不能完全满足消费者的需求。本研究运用多孔板——酶标仪相耦合的方法建立了高产丁二酮乳酸菌的高通量筛选方法,筛选高产丁二酮的乳酸菌,并对其生长特性、产香特性及代谢途径进行分析,为开发新型发酵酸奶制品提供依据。本研究的主要结论如下:（1）利用多孔板——酶标仪相耦合的方法,建立了高产丁二酮乳酸菌的高通量筛选方法,并用该方法进行乳酸菌的筛选。结果显示,用酶标法建立的标准曲线的回归方程为y=0.0149 x+0.0932,R2=0.9966,呈现良好的线性关系,且回收率和稳定性均较好;而且与常规使用的紫外分光光度法和气相色谱法呈良好的线性关系。用该方法从传统发酵酸奶中筛选出高产丁二酮的干酪乳杆菌,命名为L.casei TCS。该菌株的最适生长温度为37℃,2 h进入对数生长期,12 h左右进入平稳期;用于酸奶发酵时,4 h酸度开始发生明显变化,10 h到达发酵终点,发酵停止。（2）通过GC-MS和感官评价对四种不同干酪乳杆菌发酵酸奶的香气化合物和7种感官属性进行评价。结果显示,L.casei TCS发酵酸奶中丁二酮的含量（9.54±0.12 mg/L）远高于其他三种发酵酸奶（L.casei Zhang:4.56±0.23 mg/L、BD-II:3.78±0.28 mg/L、LC2W:2.05±0.17 mg/L）;在奶香味、典型酸奶味、奶油味和整体接受性这四种感官属性上与其他三种发酵酸奶存在显著性差异（P<0.05）。（3）采用高通量测序技术对L.casei TCS完成了全基因组测序工作。结果显示,L.casei TCS基因组由一个染色体和一个质粒组成。两者均呈环状,长度分别为3,077,701 bp和66,782 bp,平均G+C含量分别为46.28%和44.79%,分别含有3092个和71个CDSs。在L.casei TCS基因组中鉴定出3,163个基因,60个tRNA序列及15个rRNA。（4）通过优化发酵工艺参数来提高丁二酮的产量,并对其关键基因（α-als、α-aldB、ldh）的表达量进行研究。结果显示,当初始pH为6.5,接种量为4%,发酵温度为37℃时,L.casei TCS在发酵过程中更容易代谢产生丁二酮。向发酵机制中添加适量的葡萄糖、丝氨酸、Mg2+和柠檬酸钠时,均能在一定程度上提高丁二酮的产量。在发酵期不同时间与丁二酮含量存在显著正相关;丁二酮含量与关键功能基因α-als和ldh2664存在显著正相关,而与其他基因表达量相关性不显著。

论文目录

• 摘要
• abstract
• 第1章 前言
•   1.1 发酵酸奶及其风味
•   1.2 发酵酸奶中风味化合物的形成途径
•     1.2.1 糖酵解途径
•     1.2.2 蛋白质水解
•     1.2.3 脂肪水解
•   1.3 不同乳酸菌对酸奶风味的影响
•   1.4 提高丁二酮产量的策略及研究进展
•     1.4.1 乳酸菌筛选方法优化
•     1.4.2 优化培养条件
•     1.4.3 代谢工程策略
•   1.5 本课题的研究意义和内容
•     1.5.1 研究目的意义
•     1.5.2 研究内容
•     1.5.3 技术路线图
• 第2章 高产丁二酮乳酸菌的筛选及产香特性研究
•   2.1 实验材料、试剂和仪器
•     2.1.1 实验材料
•     2.1.2 实验试剂
•     2.1.3 实验仪器
•   2.2 实验方法
•     2.2.1 高产丁二酮乳酸菌高通量筛选方法的建立
•     2.2.2 乳酸菌的分离与纯化
•     2.2.3 酸奶的制备
•     2.2.4 发酵酸奶中丁二酮含量的测定
•     2.2.5 乳酸菌的鉴定
•     2.2.6 乳酸菌生长特性研究
•     2.2.7 发酵酸奶整体香气化合物分析
•     2.2.8 香气活力值（OAV值）
•     2.2.9 感官分析
•     2.2.10 数据分析
•   2.3 结果与讨论
•     2.3.1 酶标法回收率和稳定性测定结果
•     2.3.2 三种丁二酮检测方法相关性结果
•     2.3.3 不同菌株丁二酮的生产能力
•     2.3.4 菌株CA-1 的鉴定结果
•     2.3.5 16S rDNA基因序列分析
•     2.3.6 乳酸菌生长特性测定
•     2.3.7 不同发酵酸奶香气化合物定性定量结果
•     2.3.8 不同发酵酸奶特征香气化合物分析
•     2.3.9 不同发酵酸奶感官分析
• 1 的物质相关性分析'>    2.3.10 不同酸奶样品感官属性与OAV>1 的物质相关性分析
•   2.4 本章小结
• 第3章 L.casei TCS全基因组测序及比较基因组学研究
•   3.1 材料与设备
•     3.1.1 实验试剂
•     3.1.2 主要仪器与设备
•   3.2 实验方法
•     3.2.1 乳杆菌培养
•     3.2.2 干酪乳杆菌基因组的提取
•     3.2.3 L.casei TCS全基因组测序
•     3.2.4 L.casei TCS基因预测与注释
•     3.2.5 比较基因组分析
•     3.2.6 四株干酪乳杆菌氨基酸序列分析
•     3.2.7 数据处理
•   3.3 结果与讨论
•     3.3.1 干酪乳杆菌基本信息
•     3.3.2 L.casei TCS与其他干酪乳杆菌基因组共线性分析
•     3.3.3 基因功能注释
•     3.3.4 泛基因组与核心基因组分析
•     3.3.5 氨基酸代谢相关基因
•     3.3.6 蛋白的序列分析
•   3.4 本章小结
• 第4章 L.casei TCS发酵酸奶丁二酮的产生及关键基因表达量的研究
•   4.1 实验材料、试剂和仪器
•     4.1.1 主要实验材料与试剂
•     4.1.2 主要实验仪器
•   4.2 实验方法
•     4.2.1 发酵条件及前体物质对丁二酮产量的影响
•     4.2.2 L.casei TCS发酵酸奶丁二酮动态曲线的测定
•     4.2.3 L.casei TCS发酵酸奶丁二酮关键基因表达量的测定
•     4.2.4 数据处理
•   4.3 结果与讨论
•     4.3.1 培养温度对丁二酮产量的影响
•     4.3.2 初始pH对丁二酮产量的影响
•     4.3.3 接种量对丁二酮产量的影响
•     4.3.4 不同碳源对丁二酮产量的影响
•     4.3.5 不同氮源对丁二酮产量的影响
•     4.3.6 二价金属离子对丁二酮产量的影响
•     4.3.7 生长因子对丁二酮产量的影响
•     4.3.8 不同配方发酵酸奶丁二酮动态曲线的测定
•     4.3.9 L.casei TCS六种不同配方发酵酸奶发酵和储存期间RNA质量检测
•     4.3.10 L.casei TCS功能基因引物扩增质量检测
•     4.3.11 L.casei TCS功能基因表达量与丁二酮含量相关性分析
•   4.4 本章小结
• 第5章 结论、创新点和研究展望
•   5.1 结论
•   5.2 创新点
•   5.3 研究展望
• 参考文献
• 致谢
• 附录
• 攻读学位期间所开展的科研项目和发表的学术论文

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 史雨桦

导师: 田怀香,郑小平

关键词: 乳酸菌,酸奶,香气,全基因组,基因表达量

来源: 上海应用技术大学

年度: 2019

分类: 基础科学,工程科技Ⅰ辑

专业: 生物学,生物学,轻工业手工业

单位: 上海应用技术大学

分类号: Q933;TS252.1

DOI: 10.27801/d.cnki.gshyy.2019.000202

总页数: 109

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