光敏橙色类胡萝卜素蛋白OCP和光敏四吡咯色素的研究

论文摘要

光敏色素是由脱辅基蛋白与一个线性四吡咯发色团共价连接组成的光致变色蛋白,具有吸收红光和远红光两种可逆变转化形式,广泛存在于蓝藻和植物中,对生命活动具有重要的意义。通过对吸收光谱的比较发现:结合植物色素（phytochromobilin,PΦB）的植物光敏色素比结合藻蓝胆素（phycocyanobilin,PCB）的蓝细菌光敏色素（cyanobacteriochromes,CBCRs）红移约10 nm,这种光谱红移的现象,在荧光探针的开发和深层组织成像等方面具有重要的生物学研究意义。植物光敏色素在植物表达系统中表达周期长且存在时间短,对其发色团的研究和应用具有局限性,而利用大肠杆菌表达系统可以获得与天然表达性质相似的植物色素。因此,在本研究中设计了一种可以在大肠杆菌内简便获得植物色素PΦB的方法。为了提高产量,要先对表达核-膜连接蛋白(core-membrane linker protein,LCM又名ApcE)色素结合域的质粒和PΦB色素的产生质粒进行优化,然后将两者在大肠杆菌中共表达。由Synechococcus sp.PCC7335 apcE2编码的ApcE脱辅基蛋白,不仅可以提高色素的表达产量,还可以自催化结合PΦB色素,且由于传统的半胱氨酸被缬氨酸取代,色素与蛋白的结合方式由共价结合转变为非共价。通过简单的萃取方法不仅可以获得具有生物活性的游离PΦB色素,该非共价结合色素的蛋白还可以将色素直接转移到能共价结合色素的脱辅基蛋白上。在前期对蓝藻的研究中了解到除了CBCRs会在合适的光照条件下响应光的变化发生状态的转换外,在蓝藻内还存在其他光受体蛋白如蓝光受体蛋白:水溶性橙色类胡萝卜素蛋白（orange carotenoid protein,OCP）。OCP在高强光的照射下可以由稳定的OCPO态转变为激活的OCPR态,进而将藻胆体吸收的过多的光能变为热能耗散掉,保护藻细胞免受高光环境的胁迫。为了深入探究OCP蛋白的动态转换过程,本研究期望通过获得天然高分辨率晶体,以蛋白晶体为实验材料采用动态晶体学的方法,在分子水平上来阐明OCP结构在光照前后的变化。当前学者通过活性态OCP蛋白对各种类型藻胆体的非光化学淬灭（non-photochemical quenching,NPQ）机制来探究具体的作用位点,但此类方法由于受藻胆体的复杂组装形式的影响,具体的作用位点还无法确定。故本研究中第一次将藻胆体的各个亚基在大肠杆菌内单独表达,在体外加入活性态的OCP蛋白来研究各亚基的荧光淬灭情况。在体外NPQ实验中发现活性态的OCP蛋白不仅可以淬灭藻胆体的荧光,还能够淬灭藻胆体的各组成亚基如APC,CPC,PEC和蓝细菌光敏色素,绿色荧光蛋白（green fluorescence protein,GFP）和红色荧光蛋白（mCherry）的荧光。最终实验证明,淬灭荧光是OCP蛋白的本身属性,而与作用对象没有特异性,不同蛋白的荧光淬灭效果的差异,则应该是受蛋白的光谱重叠性质的影响,并进一步阐明了活性态OCP蛋白淬灭藻胆体荧光的作用机制及影响因素。这是对OCP蛋白功能和NPQ机制的深入探究,对进一步研究OCP与藻胆体的淬灭位点及作用机制具有重要的指导意义。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 缩略词（Abbreviation）
• 1 序言
•   1.1 藻胆体
•   1.2 藻胆蛋白
•     1.2.1 别藻蓝蛋白
•     1.2.2 藻蓝蛋白、藻红蛋白和藻红蓝蛋白
•   1.3 藻胆色素
•   1.4 连接蛋白
•   1.5 光敏色素
•   1.6 橙色类胡萝卜素蛋白OCP
•   1.7 光保护机制
•   1.8 课题设计及研究意义
• 2 植物光敏色素PΦB的有效制备方法
•   2.1 引言
•   2.2 实验材料与试剂
•   2.3 实验仪器
•   2.4 实验方法
•     2.4.1 藻总DNA提取
•     2.4.2 质粒构建
•     2.4.3 ApcE2 色素化蛋白在E.coli内的表达
•     2.4.4 蛋白的破碎与纯化
•     2.4.5 细胞荧光活性比较
•     2.4.6 SDS-PAGE电泳
•     2.4.7 紫外可见光谱及荧光光谱测定
•     2.4.8 摩尔消光系数和荧光量子产率的测定
•     2.4.9 可逆光转换测定
•     2.4.10 不同方法及片段色素的萃取方法及产量的比较
•     2.4.11 HPLC纯化与质谱鉴定
•     2.4.12 质谱检测的条件
•     2.4.13 脱辅基蛋白与萃取色素的体外重组
•     2.4.14 蛋白间的色素转移
•   2.5 实验结果与分析
•     2.5.1 pET-cph1（1-514）质粒的构建
•     2.5.2 PCC7335 ApcE2 蛋白与色素PΦB的连接方式
•     2.5.3 蛋白在E.coli体内的色素化结果
•     2.5.4 不同PΦB-ApcE2 蛋白色素产量比较
•     2.5.5 色素萃取方法结果比较
•     2.5.6 萃取色素的性质鉴定
•     2.5.7 游离色素PΦB与脱辅基蛋白的体外重组及光转化
•     2.5.8 PΦB色素的体外转移
•     2.5.9 体内重组与体外色素转移的对比
•   2.6 本章小结
• 3 光敏水溶性橙色类胡萝卜素蛋白OCP结晶
•   3.1 前言
•   3.2 实验材料与试剂
•   3.3 实验仪器
•   3.4 实验方法
•     3.4.1 ocp-His质粒的构建
•     3.4.2 突变藻的构建、筛选及培养
•     3.4.3 镍离子亲和层析法纯化OCP-His蛋白
•     3.4.4 阴离子交换柱进一步纯化OCP-His蛋白
•     3.4.5 目的蛋白OCP的结晶与筛选
•     3.4.6 OCP-His晶体衍射
•   3.5 结果与分析
•     3.5.1 带有抗性筛选基因的ocp-His质粒的构建结果
•     3.5.2 OCP-His突变藻的筛选结果
•     3.5.3 OCP-His蛋白的纯化结果
•     3.5.4 OCP-His蛋白的离子柱纯化结果
•     3.5.5 OCP-His蛋白的结晶
•   3.6 本章小结
• 4 OCP蛋白淬灭荧光的作用机制
•   4.1 引言
•   4.2 实验材料与试剂
•   4.3 实验仪器
•   4.4 实验方法
•     4.4.1 载体的构建与克隆
•     4.4.2 蛋白的色素化与表达
•     4.4.3 蛋白的纯化
•     4.4.4 OCP的光转化实验
•     4.4.5 藻胆体的制备及SDS-PAGE检测
•     4.4.6 OCP（W288A）与目的蛋白的NPQ
• R与藻胆体及部分藻胆蛋白的NPQ'>    4.4.7 OCP^R与藻胆体及部分藻胆蛋白的NPQ
•     4.4.8 荧光寿命测定
•     4.4.9 Stern-Volmer曲线测定
•     4.4.10 pull down实验
• R暗回复实验'>    4.4.11 OCP^R暗回复实验
•     4.4.12 荧光淬灭时间曲线的测定
•   4.5 实验结果与分析
•     4.5.1 质粒的构建结果
•     4.5.2 蛋白色素化重组结果
•     4.5.3 OCP的光转化实验结果
•     4.5.4 藻胆体的制备及光谱、SDS-PAGE检测
•     4.5.5 OCP（W288A）与目的蛋白荧光淬灭结果分析
• R与藻胆体及部分藻胆蛋白的荧光淬灭结果分析'>    4.5.6 OCP^R与藻胆体及部分藻胆蛋白的荧光淬灭结果分析
•     4.5.7 荧光寿命测定结果
•     4.5.8 藻胆体、藻胆蛋白及其他蛋白Stern-Volmer曲线测定
•     4.5.9 pull down实验结果
• R暗回复实验'>    4.5.10 OCP^R暗回复实验
•     4.5.11 荧光淬灭时间曲线的测定结果分析
•   4.6 本章小结
• 参考文献
• 附录 攻读学位期间发表的学术论文
• 致谢

文章来源

类型: 博士论文

作者: 鲁璐

导师: 赵开弘

关键词: 植物色素,藻胆体,藻胆蛋白,类胡萝卜素蛋白,非光化学淬灭

来源: 华中农业大学

年度: 2019

分类: 基础科学,工程科技Ⅰ辑

专业: 生物学,化学

单位: 华中农业大学

分类号: Q946;O657.3

DOI: 10.27158/d.cnki.ghznu.2019.000031

总页数: 120

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