两株不同H7N9病毒抗宿主天然免疫比较研究

论文摘要

H7N9流感病毒自2013年发现报道以来,已经对家禽养殖业造成了巨大的经济损失,而且病毒可以突破种间屏障,造成人的感染和发病死亡,给公共卫生安全造成了巨大的威胁。宿主的天然免疫系统在抗病毒感染的过程中发挥重要作用,比较研究不同宿主来源的H7N9流感病毒拮抗宿主天然免疫的差异,可以更好地了解病毒与宿主的相互作用,为制定防控措施提供新的思路和科学依据。为更好地了解H7N9流感病毒在拮抗宿主天然免疫方面的差异,本实验选取两株不同宿主来源的H7N9流感病毒作为模式病毒株,分别是禽源病毒A/Pigeon/Shanghai/S1421/2013（H7N9）[PG/S1421]和人源病毒A/Anhui/1/2013（H7N9）[AH/1]。两株病毒只在PB2蛋白的627位点存在一个氨基酸的差异,PG/S1421是627位谷氨酸（E）,而AH/1是627位赖氨酸（K）,但是这两株病毒对哺乳动物的致病性表现出明显的差异性。用不同剂量的两株流感病毒感染C57BL/6小鼠,连续记录小鼠的体重变化和死亡率,实验结果显示,AH/1可以造成小鼠的发病死亡,而PG/S1421则不会造成小鼠发病。病毒感染后的小鼠,肺部病理损伤程度存在差异,用ELISA实验对肺部I型干扰素水平进行检测,发现两株病毒均可以在肺部诱导I型干扰素的产生,但是AH/1感染导致肺部的I型干扰素含量更高。为了确定两株流感病毒诱导产生I型干扰素的主要通路,用I型干扰素信号通路关键分子的基因缺失小鼠,取腹腔巨噬细胞,经病毒感染后,检测I型干扰素产生情况,检测结果显示,两株流感病毒感染主要是通过RIG-I/MAVS/IRF3这一信号通路产生I型干扰素的。为进一步研究PG/S1421和AH/1诱导宿主产生I型干扰素差异的原因,首先构建了两株表达PG/S1421和AH/1的PB2蛋白的A549细胞系,用两株病毒进行感染,检测IFN-β的mRNA水平,结果发现两者对I型干扰素产生的影响不存在显著差异,表明PB2的627位点单一氨基酸差异不是造成AH/1诱导更多I型干扰素的主要原因。然后用两株病毒以相同剂量感染A549细胞和小鼠腹腔巨噬细胞,间接免疫荧光和细胞流式实验检测均显示感染效率无明显区别,表明I型干扰素产生的差异并不是由于感染效率导致的。最后用两株流感病毒感染小鼠腹腔巨噬细胞,收集上清液和细胞蛋白,ELISA实验检测上清液中IFN-β的含量,用western blotting实验检测干扰素产生通路上关键分子的表达情况,发现两株H7N9流感病毒感染腹腔巨噬细胞均会诱导I型干扰素产生,但是AH/1可以诱导更多I型干扰素产生,而且AH/1感染可以上调RIG-I的表达量,PG/S1421感染对于RIG-I的表达量则没有明显影响。本研究结果表明,禽源病毒PG/S1421感染不会造成小鼠发病,人源病毒AH/1感染则可以造成小鼠的发病和死亡,两株病毒均可诱导I型干扰素产生,但是在抗宿主天然免疫方面存在差异。AH/1感染可以通过上调RIG-I的表达,进而促进I型干扰素的产生,在宿主体内具有更高的病毒滴度提示AH/1可能逃逸了宿主天然免疫的清除,实验发现了人源流感病毒促进I型干扰素产生的初步机制,为以后更精确的分子机制研究和流感防控提供了新的思路。

论文目录

• 摘要
• abstract
• 第一章 引言
•   1.1 流感病毒病原概述
•     1.1.1 流感病毒的结构组成
•     1.1.2 流感病毒的分型
•     1.1.3 流感病毒的复制与传播
•     1.1.4 流感病毒的致病力分子基础
•   1.2 H7N9 流感病毒的发生与现状
•     1.2.1 H7N9 流感病毒的出现与发展
•     1.2.2 H7N9 流感防控现状
•   1.3 流感病毒诱导天然免疫反应
•     1.3.1 TLR受体介导的病原识别
•     1.3.2 RLR识别被感染细胞中的RNA
•     1.3.3 I型干扰素及调节因子
•   1.4 本研究的目的和意义
• 第二章 两株H7N9 病毒抗宿主天然免疫比较研究
•   2.1 材料与方法
•     2.1.1 病毒和细胞
•     2.1.2 实验动物及鸡胚
•     2.1.3 主要试剂
•     2.1.4 主要实验仪器
•   2.2 实验方法
•     2.2.1 小鼠致病力实验
•     2.2.2 小鼠脏器病毒滴度测定
•     2.2.3 荧光定量 PCR 实验
•     2.2.4 间接免疫荧光实验
•     2.2.5 酶联免疫吸附实验
•     2.2.6 Western blotting 实验
•     2.2.7 质粒和细胞系构建
•     2.2.8 统计学分析
•   2.3 实验结果
•     2.3.1 两株病毒对小鼠的致病性
•     2.3.2 两株病毒感染小鼠脏器病毒滴度
•     2.3.3 病毒感染小鼠肺脏病理变化
•     2.3.4 病毒感染在肺部诱导I型干扰素产生
•     2.3.5 两株病毒主要通过RIG-I/MAVS/IRF3 通路产生I型干扰素
•     2.3.6 AH/1 感染可以上调RIG-I表达
•   2.4 讨论
• 第三章 全文结论
• 参考文献
• 致谢
• 作者简历

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 李继清

导师: 陈化兰

关键词: 流感病毒,天然免疫,型干扰素

来源: 中国农业科学院

年度: 2019

分类: 基础科学,农业科技

专业: 生物学,畜牧与动物医学

单位: 中国农业科学院

分类号: S852.4

总页数: 46

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