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微管蛋白β-2b链突变体真核表达载体的构建及对微管聚合的研究

2020-12-08阅读(921)

微管蛋白β-2b链突变体真核表达载体的构建及对微管聚合的研究

论文摘要

微管由交替出现的α微管蛋白和β微管蛋白组成,微管蛋白β-2b链（tubulin beta-2B chain,TUBB2B）是β微管蛋白的亚型基因,它是微管的主要成分。微管蛋白基因TUBB2B的突变会改变微管的正常功能和结构。研究发现TUBB2B蛋白第247位点天冬酰胺突变为丝氨酸会导致小鼠大脑皮质的损坏和异常发育,本文就TUBB2B突变基因TUBB2B（N247S）对微管聚合的影响展开分析。本实验以C57bl/6j小鼠总RNA为模板,反转录得到cDNA,通过与T载体连接构建了TUBB2B基因克隆载体,并通过点突变技术构建了TUBB2B（N247S）基因克隆载体。使用DNA限制性酶切技术构建了TUBB2B（N247S）-p3-flag-cmv-10真核表达载体,并在转染试剂的介导下,将真核重组表达载体及空载体转染至小鼠成纤维细胞L929中,设置空白组和对照组,对不同组的细胞进行微管蛋白的提取,通过Western-blot技术对α微管蛋白表达量进行分析,收集表达的突变蛋白并通过磁分离技术进行纯化,为了研究突变蛋白对微管骨架的影响,对纯化后的突变蛋白进行体外聚合实验分析,所得结果如下:1.构建的TUBB2B以及TUBB2B（N247S）克隆载体经菌液PCR及DNA鉴定证明克隆载体构建正确。2.目的片段与真核表达载体连接成功,并通过菌液PCR,双酶切及DNA测序结果鉴定,成功构建TUBB2B（N247S）-p3-flag-cmv-10真核重组表达载体。3.成功转染L929细胞,以及成功表达突变蛋白,经过优化诱导表达条件,确定了以6孔板为准,最佳目的基因与转染试剂的比例为8:1,且实现了TUBB2B基因在L929中的高效表达。4.转染组与空白组及对照组进行比较,游离态的α微管蛋白显著高于对照组和空白组（P值分别为0.0001和0.0004）,聚合态的α微管蛋白显著低于对照组和空白组（P值分别为0.0004和0.0036）。5.磁分离技术纯化可以得到较高浓度的目的蛋白。6.TUBB2B（N247S）突变蛋白对微管蛋白体外聚合具有一定的抑制作用。

论文目录

  • 摘要
  • Abstract
  • 第一篇 文献综述
  •   1.1 微管蛋白研究现状
  •   1.2 TUBB2B突变体与人类疾病的研究进展
  •   1.3 TUBB2B突变体表型的致病机制
  •   1.4 研究目的及意义
  • 第二篇 实验内容
  •   第一章 TUBB2B（N247S）重组表达载体的构建及鉴定
  •     1 实验材料
  •       1.1 实验动物、质粒、菌株、细胞
  •       1.2 试剂
  •       1.3 主要实验仪器
  •       1.4 相关实验实验配方
  •     2 实验方法
  •       2.1 TUBB2B基因克隆载体的构建
  •       2.2 TUBB2B（N247S）突变基因克隆载体的构建
  •       2.3 真核表达载体TUBB2B（N247S）-p3-flag-cmv-10 的构建
  •       2.4 成纤维细胞L929 的培养及真核表达载体的转染
  •       2.5 重组目的蛋白的提取及鉴定
  •     3 结果与分析
  •       3.1 TUBB2B克隆载体的构建
  •       3.2 TUBB2B突变克隆载体的构建
  •       3.3 TUBB2B（N247S）-p3-flag-cmv-10 表达载体的构建
  •       3.4 表达蛋白的浓度测定及重组目的蛋白的检测
  •     4 讨论
  •     5 小结
  •   第二章 突变蛋白TUBB2B（N247S）对微管聚合影响的研究
  •     1 实验材料
  •       1.1 相关试剂
  •       1.2 主要实验仪器
  •     2 实验方法
  •       2.1 突变蛋白TUBB2B（N247S）细胞内对微管蛋白聚合的影响
  •       2.2 重组目的蛋白的纯化及鉴定
  •       2.3 重组蛋白体外聚合检验
  •     3 实验结果
  •       3.1 TUBB2B（N247S）突变对α微管蛋白的聚合状态分析
  •       3.2 重组蛋白纯化
  •       3.2 重组蛋白体外聚合检验
  •     4 讨论
  •     5 小结
  • 结论
  • 参考文献
  • 作者简介
  • 致谢
  • 附录 A:TUBB2B点突变致病情况

    • 文章来源

    类型: 硕士论文

    作者: 何天瑶

    导师: 赵福广

    关键词: 微管蛋白,微管蛋白链,真核表达,磁分离技术,体外聚合

    来源: 吉林农业大学

    年度: 2019

    分类: 基础科学

    专业: 生物学

    单位: 吉林农业大学

    分类号: Q78

    DOI: 10.27163/d.cnki.gjlnu.2019.000263

    总页数: 56

    文件大小: 2313K

    下载量: 27

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