蝙蝠腺病毒的鉴定及六邻体蛋白的克隆表达

论文摘要

研究目的近年来,蝙蝠被证实为多种重要人畜共患病毒的储存宿主,由于其具有食性复杂、飞行距离长、与人和家畜关系密切等特点,往往给人类的健康带来极大的威胁。中国东南沿海地区气候温暖湿润,地形复杂多样,是蝙蝠的理想栖息地,同时也是多种疾病的自然疫源地。研究该地区蝙蝠携带的人兽共患病毒,对了解蝙蝠病毒的种类和分布,以及对人群流行的病毒进行溯源等,均具有重要意义。腺病毒（Adenovirus）是无包膜的二十面体病毒,大小约7090nm,具有2646kb的线性双链DNA基因组。人类由腺病毒引起的疾病包括急性呼吸道疾病,流行性角膜结膜炎等。本研究以东南沿海地区蝙蝠携带的腺病毒为研究对象,通过调查该地区蝙蝠所携带腺病毒的阳性率,对阳性样本进行病毒分离,初步研究蝙蝠源腺病毒致病性及机制,为腺病毒疫情预测预警及下一步研究奠定基础。研究方法1.蝙蝠样本的采集从东南沿海地区（岱山,定海,桃花岛,厦门、长乐等）多个山洞、坑道等采集成年蝙蝠肛拭子和咽拭子,储存在液氮罐中带回实验室,将样本一分为二,一份用于提取核酸,一份放置于-80度保存备用。2.引物设计和样本种群鉴定根据NCBI已报道的蝙蝠腺病毒序列,设计多对引物,对采集的样本核酸进行PCR检测。同时用蝙蝠组织线粒体色素b引物对样本进行序列扩增和种群鉴定。对阳性样本目的片段进行割胶回收纯化,纯化产物送上海生工生物公司测序,测序结果在NCBI数据库进行BLAST比对。3.病毒的分离将腺病毒阳性样本制备的匀浆接种到6孔板中的Vero E6细胞上。将6孔板在37℃和5%CO2条件下孵育2小时以吸附病毒,期间每隔半小时轻轻晃动6孔板帮助吸附。使用新鲜培养基（DMEM）培养细胞,补充2%胎牛血清（FBS）后在37℃、5%CO2条件下继续培养2周或出现病变（CPE）。将细胞培养的上清液盲传3次以监测CPE。并根据上述方法接种到Vero E6和其它细胞系上。4.腺病毒对乳鼠的毒力将分离纯化后的腺病毒注射入出生3天的昆明株小鼠脑组织中,一组12只,每只注射100微升,另设两组对照组,一组不做任何处理,一组注射100微升DMEM。在相同条件下饲养2周后,分别取其脑、肝、肾、肺、肠组织脏器并一分为三,一份组织用于核酸提取和病毒鉴定;一份置于4%多聚甲醛中,用于后续免疫组化实验和HE染色实验;一份置于戊二醛溶液中,用于后续电镜观察。结果1.阳性率统计结果从2015至2019间从东南沿海岱山、定海、桃花岛、长乐、厦门等地共采集552只蝙蝠样本,阳性样本36只,总阳性率6.5%。种群鉴定结果显示36只阳性样本皆来自于菲菊头蝠。2.病毒分离在接种阳性样本第7天（盲传第二代）时6孔板中有3个细胞孔出现病变（CPE）,PCR检测为腺病毒阳性,继续盲传一代后CPE更明显,PCR阳性也更为明显,电子显微镜下可见明显特征的腺病毒颗粒。将得到的腺病毒液用蚀斑纯化法纯化,得到纯化后的腺病毒储存于-80度冰箱中,用于后续体内实验和深度测序。3.乳鼠攻毒实验3组昆明株乳鼠在相同条件下饲养2周后处死,取脑、肝、肾、肠、肺组织脏器并一分为三,在实验组12只乳鼠肠组织中均检测到腺病毒。两组对照组均为阴性。结论:腺病毒在东南沿海地区蝙蝠中有一定携带率,且存在一定的跨种传播几率和致病性。对东南沿海地区蝙蝠携带腺病毒的流行病和统计学研究具有重要意义。

论文目录

• 摘要
• abstract
• 缩略词与中英文注释表
• 第一章 前言
•   1.1 腺病毒的流行及危害
•   1.2 腺病毒的治疗现状
•   1.3 蝙蝠携带腺病毒的研究现状
•   1.4 蝙蝠腺病毒研究目的目的和意义
• 第二章 蝙蝠样本采集、鉴定与阳性率统计
•   2.1 实验材料
•     2.1.1 实验仪器和耗材
•     2.1.2 实验试剂
•   2.2 实验方法
•     2.2.1 蝙蝠样本的采集
•     2.2.2 蝙蝠样本核酸提取
•     2.2.3 琼脂糖凝胶电泳
•     2.2.4 阳性率的统计
•   2.3 实验结果
•     2.3.1 样本统计结果
•     2.3.2 PCR检测腺病毒结果
•   小结与讨论
• 第三章 腺病毒的分离
•   3.1 实验材料
•     3.1.1 实验主要仪器和耗材
•     3.1.2 实验试剂
•   3.2 实验方法
•     3.2.1 细胞培养
•     3.2.2 病毒的分离
•     3.2.3 病毒的检测
•     3.2.4 深度测序
•   3.3 实验结果
•     3.3.1 病毒分离结果
•     3.3.2 透射电子显微镜结果
•     3.3.3 测序数据
•     3.3.4 组装结果
•     3.3.5 组装结果比对统计
•     3.3.6 数据库比对
•     3.3.7 进化树分析
•   小结与讨论
• 第四章 蝙蝠腺病毒毒力实验
•   4.1 实验材料
•     4.1.1 实验动物
•     4.1.2 实验材料
•     4.1.3 实验试剂
•   4.2 实验方法
•     4.2.1 动物模型构建
•   4.3 实验结果
•     4.3.1 腺病毒增殖检测
•   小结与讨论
• 第五章 六邻体蛋白的表达
•   5.1 实验材料
•   5.2 实验方法
•     5.2.1 Henxon蛋白生物信息学分析
•     5.2.2 合成六邻体蛋白序列
•     5.2.3 构建p ET28a/Hexon载体
•     5.2.4 六邻体蛋白的表达
•     5.2.5 六邻体蛋白的纯化
•   5.3 实验结果
•     5.3.1 六邻体蛋白的序列
•     5.3.2 稀有密码子分析
•     5.3.3 跨膜域的预测
•     5.3.4 蛋白质大小和等电点的预测
•     5.3.5 六邻体蛋白的成功表达
•     5.3.6 六邻体蛋白的纯化
•   小结与讨论
• 第六章 总结与展望
•   6.1 主要结论
•   6.2 实验中的不足
•   腺病毒引起人类感染的研究现状与展望
•     与病原体直接接触
•     宿主转换
•     病毒的传播
• 参考文献
• 文献综述
•   参考文献
• 致谢
• 在学期间发表的论文及在学期间参加学术会议

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 章文

导师: 钱晖,王长军,谭伟龙

关键词: 蝙蝠,腺病毒,跨种传播,媒介宿主

来源: 江苏大学

年度: 2019

分类: 基础科学,医药卫生科技

专业: 生物学,基础医学

单位: 江苏大学

基金: 国家重大传染病专项(2013ZX1004103-004),国家自然科学基金项目(U1602223),江苏省社会发展项目(BE2017620)

分类号: R373

总页数: 70

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