猪星状病毒2型、3型、5型抗体间接ELISA检测体系的建立

论文摘要

猪星状病毒（Porcine Astrovirus,PoAstV）是一种可以引发猪病毒性腹泻的单股正链RNA病毒,目前已发现的基因型共有五种（PoAstV 1-5）,在我国分布广泛。不同基因型之间差异较大,其基因组序列同源性仅有40%左右。此前对PoAstV的检测以逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）之类的方法为主,但这些方法只检测病毒抗原。目前关于星状病毒衣壳蛋白的研究主要集中于人类星状病毒（Human Astrovirus,HAstV）,对于PoAstV抗原蛋白的研究较少。本研究利用原核表达系统表达了PoAstV的衣壳蛋白并建立起ELISA方法对PoAstV进行了血清学检测;同时利用表达的蛋白免疫小鼠确定免疫原性最佳的抗原蛋白。本研究建立了快速灵敏检测PoAstV2、3和5型抗体的检测体系,具体结果如下:1.根据HAstV衣壳蛋白的三个结构域Inner,Outer,Spike,预测并表达,PoAstV衣壳蛋白的相同区域。分别以本实验室国内检测到的PoAstV 2、PoAstV 5以及已发表的PoAstV 3（NC019494）毒株为模板,设计相应的表达引物,扩增编码PoAstV 2衣壳蛋白三个结构域的片段,分别连接至pCold-TF原核表达载体,同时,扩增PoAstV 3和PoAstV 5的衣壳蛋白的3个片段连接至pHUE原核表达载体,表达相应重组蛋白并纯化,通过Western Blot鉴定,确定表达的蛋白为所需目的蛋白。2.利用目的蛋白免疫小鼠获得含有多克隆抗体的阳性血清,经ELISA检测各蛋白免疫小鼠血清效价并确定Spike蛋白的抗原性最强,因此将Spike蛋白确立为间接法检测PoAstV抗体的包被抗原蛋白。通过预试验确定了最佳反应条件:最佳包被抗原稀释浓度为2.5 ng/孔;最佳样品血清稀释度为1:100;最佳山羊抗猪酶标二抗稀释度为1:10000;最佳底物显色时间为12 min。确定了PoAstV 2,PoAstV 3和PoAstV 5的S/P cut-off值分别为42.9,31.07和29.85。经重复试验进一步验证同批次或不同批次酶标板变异系数均小于15%,证实PoAstV-ELISA法有较好的稳定性。随后采用构建好的ELISA血清学检测方法检测来自湖南省及江西省六个不同县的养猪场的272份血清样品。发现PoAstV 2阳性率为35.66%,PoAstV 3阳性率为44.12%,而PoAstV 5阳性率仅为2.94%,表明不同基因型的PoAstV其流行趋势有很大的不同。通过本研究表明本实验表达的PoAstV 2-Spike,PoAstV 3-Spike和PoAstV 5-Spike蛋白具有较好的抗原性,本实验建立的ELISA检测体系具有良好稳定性的,可为今后PoAstV的检测提供一种新的血清学方法,也为PoAstV衣壳蛋白研究的提供新的数据。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第1章 绪论
•   1.1 星状病毒概述
•     1.1.1 星状病毒
•     1.1.2 星状病毒的基本结构
•     1.1.3 星状病毒结构蛋白研究
•     1.1.4 星状病毒的重组
•     1.1.5 星状病毒的跨物种传播
•   1.2 人新型星状病毒
•     1.2.1 HAstV-MLB型
•     1.2.2 HAstV-VA型
•   1.3 猪星状病毒
•     1.3.1 PoAstV-1型
•     1.3.2 PoAstV-2型
•     1.3.3 PoAstV-3型
•     1.3.4 PoAstV-4型
•     1.3.5 PoAstV-5型
•   1.4 牛、羊新型星状病毒
•     1.4.1 BoAstV CH13/NeuroS1型
•     1.4.2 BoAstV BH89/14 型、BoAstV-CH15 型、OvAstV-CH16型
•   1.5 其他哺乳动物新型星状病毒
•     1.5.1 水貂新型星状病毒
•     1.5.2 兔新型星状病毒
•     1.5.3 蝙蝠新型星状病毒
•   1.6 星状病毒检测方法
•     1.6.1 电镜检测方法
•     1.6.2 RT-PCR检测方法
•     1.6.3 环介导等温扩增技术
•     1.6.4 酶联免疫吸附检测法
•   1.7 本课题研究目的和意义
• 第2章 PoAstV重组Inner,Outer,Spike蛋白原核表达与鉴定
•   2.1 前言
•   2.2 试验材料
•     2.2.1 试验试剂与耗材
•     2.2.2 仪器设备
•   2.3 试验方法
•     2.3.1 PoAstV2 基因的合成与克隆
•     2.3.2 PoAstV3 基因的合成与克隆
•     2.3.3 PoAstV5 基因的合成与克隆
•     2.3.4 PoAstV2 重组质粒的诱导表达
•     2.3.5 PoAstV3 重组质粒的诱导表达
•     2.3.6 PoAstV5 重组质粒的诱导表达
•   2.4 实验结果
•     2.4.1 PoAstV2 重组蛋白表达
•     2.4.2 PoAstV3 重组蛋白表达
•     2.4.3 PoAstV5 重组蛋白表达
•   2.5 结果与讨论
• 第3章 间接ELISA抗体检测方法的建立
•   3.1 前言
•   3.2 实验材料
•     3.2.1 实验试剂与耗材
•     3.2.2 实验溶液配制
•   3.3 实验方法
•     3.3.1 PoAstV样本处理
•     3.3.2 抗原蛋白抗体间接ELISA检测最佳反应条件确立
•   3.4 实验结果分析
•   3.5 结果与讨论
• 结论与展望
• 参考文献
• 致谢

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 宋雅婷

导师: 肖朝庭,刘灿

关键词: 原核表达,血清学检测

来源: 湖南大学

年度: 2019

分类: 基础科学,农业科技

专业: 生物学,畜牧与动物医学

单位: 湖南大学

分类号: S852.659.6

DOI: 10.27135/d.cnki.ghudu.2019.001563

总页数: 77

文件大小: 1317K

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