猪圆环病毒2型病毒样颗粒疫苗研制与免疫保护效力评价

论文摘要

猪圆环病毒2型（Porcinecircovirus type2,PCV2）是猪圆环病毒相关疾病（Porcine circovirus-associated disease,PCVAD）的病原,给世界养猪业带来重大的经济损失。PCV2有2a、2b、2c、2d和2e五个基因型,我国流行基因型主要有2a、2b、2d和2e。PCVAD主要靠疫苗接种进行控制,所用疫苗主要有灭活苗和亚单位疫苗,其中灭活苗用PK-15细胞生产,但病毒滴度和抗原含量低;亚单位疫苗可用大肠杆菌或杆状病毒-昆虫细胞系统表达,但纯化工艺较复杂、生产成本较高。另外,PCV2疫苗需与免疫佐剂配合使用才能取得良好的免疫保护效果,但传统免疫佐剂不能刺激细胞免疫应答,新型水包油包水佐剂虽能刺激细胞免疫应答但价格较贵。PCV2基因组含干扰素刺激应答元件,在该病毒对干扰素（Interferon,IFN）应答中发挥重要作用,用重组IFN处理PK-15细胞可显著提高PCV2产量。类弹性蛋白多肽（Elastin-like polypeptide,ELP）是根据弹性蛋白重复序列合成的多聚体,具有温度敏感的可逆相变特性,其融合蛋白可用简单的相变循环纯化。另外,ELP具有免疫原性低、体内相容性好和可降解等优点,已被用作药物传送载体、组织工程材料和免疫佐剂。Toll样受体（Toll-like receptor,TLR）等模式识别受体在先天性和获得性免疫应答中发挥重要作用,TLR配体是很有应用前景的新型免疫佐剂。本研究的主要目的是将细胞克隆法与IFN基因导入法相结合,建立PCV2高易感PK-15细胞系;将ELP与PCV2 Cap蛋白进行融合表达,利用纯化蛋白获得PCV2病毒样颗粒（Virus-like particle,VLP）;在选用TLR配体佐剂基础上,通过动物免疫试验对VLP免疫效率进行评价。1.猪γ干扰素转基因PCV2高易感PK-15细胞系建立为了建立PCV2高易感PK-15细胞系,本研究先用有限稀释法获得PK-15细胞克隆,感染PCV2后用间接免疫荧光试验进行细胞克隆筛选,结果显示在96个细胞克隆中,8.3%对PCV2不易感,77.1%易感性较低,仅14.6%易感性较高,命名为PK-15hlgher。然后以SB（Sleeping beauty）转座子为基因导入载体,将猪IFN-y与IgGFc片段融合基因（IFNg-Fc）导入PK-15higher细胞,用PCR筛选转基因细胞克隆,结果在筛选的24个细胞克隆中,随机整合细胞克隆（命名为PK15-IFNgRan）占42%,定点整合细胞克隆（命名为PK15-IFNgSB）占58%;RT-PCR和蛋白表达检测结果显示,两种细胞克隆均能正确表达目的基因,表达的IFNg-Fc融合蛋白能分泌到细胞外,具有较强的抗病毒活性。将PK15-IFNgSB和PKI5-IFNgRan细胞系连续传25代,定量PCR检测结果显示均可稳定传代。PCV2感染后进行间接免疫荧光试验、病毒滴定和定量PCR检测,结果与未克隆PK-15细胞相比,PK-15higher、PK15-IFNgRan和PK15-INgSB细胞系的 PCV2 滴度（TCID50）分别提高 1.2、2.0和2.6 log10,病毒基因组拷贝数显著增加。这些研究结果表明,PK15-IFNgRan和PK15-IFNgSB细胞系可作为长效干扰素生产细胞,不含抗性基因的PK15-IFNgSB细胞系可用于PCV2疫苗生产。2.ELP融合PCV2VLP疫苗的研制为了研制PCV2新型亚单位疫苗,本研究将PCV2a、2d和2e中和抗原表位编码序列与PCV2b Cap基因串联,分别克隆入组氨酸标签（His-tag）融合表达载体pET-30a和ELP融合表达载体pET-ELP;分别将重组载体pET-Cap和pELP-Cap转化BL21（DE3）大肠杆菌,用IPTG诱导融合蛋白表达,分别用镍亲和柱和相变循环进行融合蛋白纯化。结果显示Cap-His和ELP-Cap融合蛋白均获得正确表达,相变循环纯化的ELP-Cap蛋白纯度为94.3%,表达量为56.2mg/L,回收率为74.6%,产量为41.9mg/L,纯化过程需时2.5h;镍亲和柱纯化的Cap-His融合蛋白纯度为90%,表达量为49.4mg/L,回收率为60.8%,产量为30mg/L,纯化过程需时23h。两种融合蛋白均能形成典型的病毒样颗粒,分别命名为VLP和ELP-VLP。小鼠免疫结果显示VLP和ELP-VLP均能诱导Cap特异抗体应答,并能刺激IL-4、IFN-γ和TNF-α产生,其中ELP-VLP的免疫原性较强。攻毒保护试验结果显示在攻毒后14天,ELP-VLP和VLP免疫组的PCV2病毒血症滴度较对照组分别下降2.3和1.8 log10/mL。这些研究结果表明ELP-VLP可作为PCV2新型亚单位疫苗进一步研发。3.ELP融合PCV2VLP疫苗免疫佐剂的选择为了选择合适的PCV2 VLP疫苗佐剂,本研究用重组大肠杆菌表达三种不同的TLR配体,分别是TLR2配体脑膜炎奈瑟菌脂蛋白Ag473、TLR5配体创伤弧菌鞭毛蛋白FlaB和TLR2/4配体结核分枝杆菌热应激蛋白70（Heat shock protein 70,Hsp70）。分别将重组Ag473、FlaB和Hsp70与ELP-VLP进行小鼠免疫试验,设不完全弗氏佐剂（IFA）和新型水包油包水佐剂ISA206对照,用间接ELISA检测Cap蛋白特异抗体,外周血淋巴细胞经ELP-VLP刺激后用试剂盒检测IL-4、IFN-γ和TNF-α表达。结果显示在三种分子佐剂中,Ag473的体液和细胞免疫佐剂活性较强,尽管免疫佐剂活性低于ISA206,但明显优于油乳剂。免疫小鼠攻毒保护试验结果显示,Ag473佐剂组的PCV2病毒血症滴度下降3log10/mL,表明Ag473可作为PCV2亚单位疫苗免疫佐剂进一步研究。4.ELP融合PCV2 VLP疫苗的免疫保护效力评价为了评价ELP-VLP疫苗的免疫保护效力,分别用VLP+Ag473、ELP-VLP+Ag473和国产PCV2亚单位疫苗免疫21日龄仔猪,免疫后7、14、21和28天采血分离血清,用间接ELISA检测Cap蛋白特异抗体,用病变抑制试验检测PCV2中和抗体;在免疫后28天用105TCID50/头PCV2滴鼻攻毒,攻毒后7、14和28天采血分离外周血淋巴细胞,经ELP-VLP或PCV2刺激后用试剂盒检测IFN-γ表达;在免疫后7、14和21天采血分离血清,用定量PCR检测病毒血症滴度。结果显示在免疫后14天,VLP+Ag473和ELP-VLP+Ag473免疫组ELISA抗体水平明显高于对照疫苗免疫组,随后抗体水平差异逐渐缩小,第28天时无明显差异;从免疫后7～28天,三个免疫组的中和抗体水平无显著差异;在攻毒后7～28天,ELP-VLP+Ag473免疫组的外周血淋巴细胞IFN-y表达水平与VLP+Ag473免疫组接近或略高,但明显高于对照疫苗免疫组;在攻毒后7～21天,三个免疫组的病毒血症滴度无显著差异,但明显低于非免疫攻毒对照组。这些研究结果表明ELP-VLP+Ag473免疫保护效果与国产亚单位疫苗相当,但具有制备工艺简单、生产成本降低等优点,可以作为PCV2新型亚单位疫苗开发和使用。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 符号说明
• 第一篇 文献综述
•   第一章 猪圆环病毒的研究进展
•     1 概述
•     2 PCV2形态结构与特性
•     3 PCV2基因组结构
•     4 PCV2基因型
•     5 PCV2复制
•     6 流行病学特点
•     参考文献
•   第二章 PCV2疫苗的研究进展
•     1 灭活疫苗
•     2 减毒活疫苗
•     3 基因工程疫苗
•     4 新型佐剂
•     5 新型佐剂在PCV2疫苗中的应用
•     结语
•     参考文献
• 第二篇 实验研究
•   第一章 猪γ干扰素转基因PCV2高易感PK-15细胞系建立
•     1 材料与方法
•     2 结果
•     3 讨论
•     参考文献
•   第二章 类弹性蛋白多肽融合PCV2病毒样颗粒样疫苗的研制
•     1 材料与方法
•     2 结果
•     3 讨论
•     参考文献
•   第三章 PCV2病毒样颗粒疫苗免疫佐剂的选用
•     1 材料与方法
•     2 结果
•     3 讨论
•     参考文献
•   第四章 ELP融合PCV2病毒样颗粒疫苗的猪免疫保护效果评价
•     1 材料与方法
•     2 结果
•     3 讨论
•     参考文献
• 全文总结
• 试验主要溶液试剂及配置方法
• 致谢
• 攻读学位期间发表的学术论文

文章来源

类型: 博士论文

作者: 李洋洋

导师: 孙怀昌

关键词: 猪圆环病毒型,高易感细胞系,细菌脂蛋白佐剂,免疫效力评价

来源: 扬州大学

年度: 2019

分类: 基础科学,农业科技

专业: 生物学,畜牧与动物医学

单位: 扬州大学

基金: 江苏省高等学校优势学科建设工程项目(PAPD),中国国家重点研发计划(编号:2018YFC0840404-3)

分类号: S852.65

DOI: 10.27441/d.cnki.gyzdu.2019.000123

总页数: 113

文件大小: 7422K

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