人源BCCIP对YY1蛋白稳定性作用及其对BCCIP基因的转录调控机制

论文摘要

表观遗传学是20世纪80年代逐渐兴起的一门学科,是在研究与经典的孟德尔遗传学遗传法则不相符的许多遗传过程中逐步发展起来的。表观遗传学是指在基因组的核苷酸序列不发生改变的情况下,基因表达的可遗传变化的一门遗传学分支。本论文主要围绕人源INO80/YY1染色质重塑酶复合物受抑癌基因BCCIP的调控而展开。BCCIP（BRCA2 and CDKN1A interacting protein）是一个与乳腺癌易感基因2（breast cancer susceptibility gene 2,BRCA2）和p21（cyclin-dependent kinase inhibitor 1A,CDKN1A）相互作用的蛋白质。在细胞有丝分裂、细胞周期调控、胞质分裂、DNA损伤的同源重组修复、基因组的稳定性以及参与基因转录调控等方面起着重要作用。YY1（Yin Yang1）作为GLI-Kruppel家族中的一员,最初被认为是一种DNA结合蛋白质,随着研究的深入发现YY1是人源INO80染色质重塑复合物的一个特异性亚基,参与调控多种细胞进程。YY1蛋白上既含有转录激活区又含有转录抑制区,可以广泛的调节基因的转录活性。大量的研究表明,YY1可以通过募集不同的转录因子到YY1的不同区域从而调节基因转录的激活或抑制。我们的前期研究发现BCCIP基因受到INO80/YY1复合物的调控,BCCIP为INO80/YY1染色质重塑酶复合物的一个调控靶基因。通过对UCSC Genome Browser数据库中ChIP-Seq数据进行分析,发现在几种人的癌细胞系中YY1可以募集到BCCIP转录起始位点。但是BCCIP对YY1蛋白的稳定性作用是否会影响YY1在BCCIP启动子区域的募集尚不清楚。在人结肠癌细胞系中,我们的研究数据表明转录因子YY1调控BCCIP基因转录,而BCCIP蛋白又对YY1蛋白起着稳定作用,因此可以推断存在一个YY1-BCCIP-YY1的正反馈调节环。在细胞结肠癌细胞中,过表达BCCIP,可以提高YY1蛋白表达水平,敲低BCCIP则可以降低YY1的蛋白表达水平。此外,通过免疫共沉淀的方法证实了BCCIP和YY1蛋白可以直接结合,其结合的区域为BCCIP的N-端酸性结构域和中间保守结构域与YY1/146-270aa区域。进一步,YY1蛋白的稳定性与BCCIP蛋白中间保守结构域介导的YY1的泛素化途径有关。BCCIP基因的启动子区域包含了转录因子YY1的特异结合位点（CCGCCATC）,在荧光素报告实验中,该结合位点可以影响pGL4-BCCIP-Luc荧光素酶的转录活性。在慢病毒介导的BCCIP敲低细胞系中,进行ChIP实验,我们发现,由于YY1蛋白的稳定性降低,从而使其在BCCIP基因启动子区域近端的募集峰降低,并且这种降低无法通过过表达YY1恢复。此外,在敲低YY1时,抑制了BCCIP蛋白本身在其基因启动子区域近端的募集,以上研究表明,YY1转录因子在对BCCIP基因转录时可以通过BCCIP蛋白本身以YY1转录因子依赖的方式进行调节。

论文目录

• 摘要
• abstract
• 英文缩略词表
• 第一章 绪论
•   第一节 研究背景
•     1.1 表观遗传学概述
•     1.2 表观遗传学调控的分子机制
•     1.3 表观遗传学调控的意义
•     1.4 BCCIP的结构和功能
•     1.5 INO80 染色质重塑酶复合物
•     1.6 YY1 转录调控因子
•     1.7 泛素化
•   第二节 研究目的、意义和内容
•     2.1 研究目的和立题依据
•     2.2 研究内容
• 第二章 材料与方法
•   第一节 实验材料
•     1.1 实验仪器
•     1.2 实验试剂
•     1.3 实验所用抗体
•     1.4 质粒构建
•     1.5 细胞株
•   第二节 实验方法
•     2.1 细胞培养
•     2.2 提取细胞total RNA（RNA extraction）
•     2.3 RNA反转录（Reverse transcription）
•     2.4 实时定量PCR（qPCR）
•     2.5 免疫印迹实验（Western Blot）
•     2.6 细胞免疫共沉淀（Co-IP）
•     2.7 细胞转染
•     2.8 细胞内源性IP
•     2.9 体外 IP 实验
•     2.10 慢病毒感染系统
•     2.11 Luciferase/Renilla双荧光实验系统
•     2.12 细胞免疫荧光染色（IF）
•     2.13 染色质免疫共沉淀反应（ChIP）/Re-ChIP
•     2.14 体外核小体重组实验
•     2.15 链霉亲和素 IP 实验
•     2.16 昆虫系统表达纯化蛋白
•     2.17 数据统计
• 第三章 在结肠癌细胞系HCT116CELL（P53+/+）中BCCIP可以稳定细胞中YY1的蛋白水平
•   第一节 引言
•   第二节 实验结果与分析
•     2.1 BCCIP可以稳定内源YY1 蛋白的表达水平
•     2.2 BCCIP与 YY1 蛋白在细胞内共定位
•     2.3 BCCIP可以稳定外源性YY1 蛋白的表达水平
•     2.4 BCCIP可以延长YY1 蛋白的半衰期
•   第三节 本章小结
• 第四章 BCCIP可以与YY1 蛋白直接结合
•   第一节 引言
•   第二节 实验结果与分析
•     2.1 BCCIP与 YY1 蛋白在体外实验中的直接结合作用
•     2.2 BCCIP与 YY1 蛋白之间相互作用的结构域
•   第三节 本章小结
• 第五章 BCCIP的中间保守结构域（ICD）稳定YY1 的蛋白水平
•   第一节 引言
•   第二节 实验结果与分析
•     2.1 BCCIP稳定YY1 蛋白水平是YY1与BCCIP结合的结构域起了重要作用
•     2.2 BCCIP的 ICD结构域在细胞内稳定YY1 蛋白的全长及其结合区YY1/146-270aa截短蛋白
•     2.3 BCCIP稳定YY1 蛋白水平的机制是通过抑制YY1 的泛素化途径
•     2.4 BCCIP中间保守区域（ICD）抑制了YY1 蛋白的泛素化降解
•     2.5 YY1 的泛素化连接酶 E3 SMURF2 对 BCCIP 影响的泛素化途径的影响
•   第三节 本章小结
• 第六章 HCT116 P53（+/+）结肠癌细胞中BCCIP基因的转录调控与YY1蛋白的稳定性
•   第一节 引言
•   第二节 实验结果与分析
•     2.1 染色质免疫沉淀实验（ChIP/Re-ChIP）设计
•     2.2 BCCIP与 YY1 蛋白共同募集在BCCIP基因启动子区域
•     2.3 BCCIP对 YY1 蛋白的稳定性并介导了YY1在BCCIP基因启动子区域的募集
•     2.4 过表达BCCIP可以激活内源BCCIP基因的转录水平
•     2.5 BCCIP以 YY1 依赖方式结合到BCCIP启动子区域并激活其基因转录
•   第三节 本章小结
• 第七章 BCCIP基因启动子区域YY1 结合序列对BCCIP启动子荧光素酶活性激活作用
•   第一节 引言
•   第二节 实验结果与分析
•     2.1 BCCIP基因启动子区域的分段设计及荧光素酶活性检测
•     2.2 转录因子YY1 募集到BCCIP基因启动子上YY1 的结合位点并转录激活BCCIP基因的转录
•     2.3 BCCIP蛋白对YY1 介导的BCCIP基因转录调控模型
•   第三节 本章小结
• 第八章 总结与展望
•   第一节 总结与讨论
•   第二节 后续工作与展望
• 参考文献
• 作者简介及博士期间获得的科研成果
• 致谢

文章来源

类型: 博士论文

作者: 隋毅

导师: 蔡勇

关键词: 转录调节,蛋白稳定性,蛋白与蛋白相互作用

来源: 吉林大学

年度: 2019

分类: 基础科学,医药卫生科技

专业: 生物学,基础医学

单位: 吉林大学

分类号: R394

总页数: 124

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