导读:本文包含了小鼠受精卵论文开题报告文献综述、选题提纲参考文献及外文文献翻译，主要关键词:受精卵,小鼠,蛋白,激酶,体外,磷酸酶,单细胞。
小鼠受精卵论文文献综述
刘艳春[1]（2018）在《PKCδ/Cdc25B通路对小鼠受精卵早期发育调控机制的研究》一文中研究指出目的:自1977年发现以来,蛋白激酶C(PKC)作为细胞内信号转导体系中的一个重要激酶,参与了细胞内的不同类型的生命形式,包括细胞的生长、细胞分化,进而调节细胞周期,PKC参与的细胞调亡可能和肿瘤发生有关,在很多疾病的发生发展过程中也起到重要作用。PKC的多种亚型在不同细胞中的定位、表达和功能的不同,为PKC能够在多种信号传递系统中发挥作用提供了重要基础和保证,由于细胞可以同时合成不同亚型的PKC,导致PKC参与生长调控的分子机制变得更加复杂和多样化。细胞周期的调控是一个复杂的过程,受控于多种磷酸酶与磷酸激酶作用下的中心调控体系。作为PKC家族的一员,PKCδ是参与细胞内外信号转导的一个重要激酶,因此,探讨PKCδ信号通路在细胞周期调控中的作用,具有重要意义。Cdks是周期蛋白(cyclin)依赖性激酶,与周期蛋白结合活化后,共同对细胞周期进行调节。在细胞周期中,cdks参与调控G2/M的转换。Cyclin作为cdks的调节亚基,与其结合后形成Cyclin/cdk复合物,当cdks处于活化状态时,从而发挥对细胞周期的调控作用。MPF为异二聚体,是G2/M转换的调节者,由Cdc2和CyclinB构成。有丝分裂前,由于Cdc2的Tyr15和Thr14残基发生磷酸化,Cdc2处于失活状态,形成M期促进因子(MPF)的无活性前体,在有丝分裂期MPF可以被Cdc25活化,这两个位点被去磷酸。G2向M期的转换离不开Cdc2的调控,在Cdc25B磷酸酶的作用下,Cdc2发生去磷酸化后被激活,从而激活MPF,使早期有丝分裂开始启动。卵母细胞能够快速恢复到减数分裂的进程中去,也主要受到Cdc25B的调节。小鼠受精卵的早期发育过程,尤其是1-细胞期向2-细胞期的转换机制是国际上研究的热点和难点。PKCδ在MⅡ,2-细胞期小鼠受精卵中均被检测到,但它对受精卵早期发育调控机制少有报道,本实验室前期研究表明PKC可通过激活MPF促进小鼠受精卵的发育,且PKC在M期的活性增强,还有研究认为PKCδ组成了PKC活性的大部分,PKCδ在M期的表达量增多很可能和PKC在M期的活性增强有关,本实验以小鼠1-细胞期受精卵为研究对象,观察了PKCδ在小鼠1-细胞期受精卵四个分期中的mRNA和蛋白水平的表达及定位,并利用PKCδ的抑制剂Rottlerin以及特异性的siRNA处理1-细胞期受精卵,观察受精卵细胞的分裂情况,探讨了PKCδ在小鼠受精卵早期发育过程中的作用及其机制。应用Scansite软件预测Cdc25B-Ser96(96位丝氨酸)可能为PKCδ特异性磷酸化位点,在哺乳动物细胞内Cdc25B是否为PKCδ的直接作用底物,Cdc25B-Ser96对小鼠受精卵细胞周期的调节作用尚未见报道。因此,进一步观察PKCδ/Cdc25B信号转导通在小鼠l-细胞期受精卵发育中的调控作用,尤其是G2/M转变过程中对Cdc25B和MPF的调控作用,对阐明PKCδ调控哺乳动物细胞周期的机制有重要意义。研究方法:本研究选用昆明系SPF级小鼠,雌性4-6周,20-24g,雄性8周,30-35g,都来自于中国医科大学实验动物中心,通过分别对小鼠进行腹腔注射孕马血清促性腺激素(pregnant mare’s serum gonadotropin,PMSG)及人绒毛膜促性腺激素(human chorionic gonadotropin,hCG)超排卵和受精,取小鼠受精卵放入M16培养液中培养至指定时间收集G1,S,G2,M期受精卵,分别设置实验组和对照组,进行如下研究:(1)Real time-PCR观察PKCδ在1-细胞期小鼠受精卵各期中的表达。(2)Western-blot观察PKCδ在1-细胞期小鼠受精卵各期中的表达。(3)间接免疫荧光实验观察PKCδ,Cdc25B蛋白的亚细胞定位。(4)在经PKCδ特异性抑制剂预处理和PKCδ特异siRNA显微注射的条件下,观察小鼠受精卵的卵裂率并测定MPF活性,Cdc2-Tyr15的磷酸化状态。(5)用Cdc25BSer96的特异性磷酸化抗体检测在Cdc25B分别在G1,S,G2,M期的磷酸化状态。(6)预测PKCδ潜在底物的磷酸化位点,以pBSK-Cdc25B-WT为模板用定点突变技术构建Cdc25B模拟磷酸化和去磷酸化的突变体,在体外将各突变体转录成mRNA。(7)将体外转录Cdc25B-mRNAs分别显微注射到G1期受精卵中,测定Cdc25B蛋白表达水平,观察小鼠受精卵的卵裂率并测定MPF活性,Cdc2-Tyr15的磷酸化状态。(8)在抑制剂Rottlerin存在的条件下,抑制PKCδ活性,显微注射Cdc25B-mRNAs,测定Cdc25B蛋白表达水平,观察小鼠受精卵的卵裂率并测定MPF活性,Cdc2-Tyr15的磷酸化状态。(9)PKCδ-siRNA与Cdc25B-mRNAs共同显微注射到各期受精卵中,测定Cdc25B蛋白表达水平,观察小鼠受精卵的卵裂率并测定MPF活性,Cdc2-Tyr15的磷酸化状态。结果:1、PKCδ在小鼠受精卵各个时期(G1,S,G2,M)mRNA和蛋白水平均表达,且在M期的表达明显高于其他时期,蛋白表达与mRNA水平表达一致,且PKCδ在M期的活性较强,亚细胞定位显示PKCδ,Cdc25B在各期均有分布。2、抑制PKCδ活性,卵裂率下降,MPF活性降低,小鼠受精卵的发育受到抑制。siRNA显微注射,降低小鼠受精卵的卵裂率,降低MPF活性,抑制受精卵的分裂。3、在G2,M期可以检测到Cdc25BSer96的磷酸化条带,表明Cdc25BSer96在G2,M期被磷酸化。4、显微注射Cdc25B-S96D(Asp)-mRNA能提前激活MPF,明显促进受精卵卵裂。5、当PKCδ活性受到抑制时(rotterlin存在条件下,或siRNA显微注射),显微注射Cdc25B-S96D-mRNA可逆转PKCδ活性受到抑制时引起的G2/M期阻滞,促进1-细胞期受精卵发育。结论:1、PKCδ在在1-细胞期受精卵的各个时期均表达,且在M期的表达量明显增多活性增强。2、PKCδ的特异性抑制剂和siRNA显微注射延迟MPF的激活,进而抑制小鼠受精卵的G2/M期转换,降低卵裂率,PKCδ对小鼠受精卵的发育起正调控作用。3、Cdc25BSer96在G2,M期被磷酸化,显微注射模拟Ser96磷酸化的Cdc25B-mRNA可以明显促进受精卵的发育,PKCδ/Cdc25B通路对小鼠受精卵的发育有重要的调控作用。Cdc25B可能是PKCδ作用的直接底物,PKCδ通过对Cdc25B96位Ser的磷酸化修饰,激活MPF,从而促进G2/M期转换。(本文来源于《中国医科大学》期刊2018-10-01）
李森,王洋,郑晓娇,刘玲玲,冯晨[2]（2018）在《肌醇多磷酸5磷酸酶PIPP在小鼠受精卵内对细胞周期蛋白Cdc2的影响》一文中研究指出目的研究脯氨酸丰富的肌醇多磷酸5磷酸酶(PIPP)在小鼠1-细胞期胚胎中的定位以及它对Cdc2在Tyr15位点磷酸化的调节作用。方法提取质粒、酶切鉴定并转染PEFBOS PIPP质粒以及空载体PEFBOS vector到小鼠受精卵,用免疫荧光染色检测PIPP的定位,Western blot检测PIPP对Cdc2在Tyr15位点磷酸化的影响。结果PIPP的定位在小鼠受精卵有丝分裂过程中不断变化,并且PIPP在小鼠受精卵中的过度表达增加了Cdc2在Tyr15位点的磷酸化。结论 PIPP存在于小鼠受精卵中并通过调节Cdc2的磷酸化参与小鼠受精卵的有丝分裂过程。(本文来源于《解剖科学进展》期刊2018年04期）
王美娇[3]（2018）在《AuroraA/Bora,PLK1在小鼠受精卵有丝分裂中功能的研究》一文中研究指出目的:有丝分裂的分子机制一直是分子生物学研究的热点问题,近年来对有丝分裂相关激酶的研究也取得了一定进展。在体细胞有丝分裂中,保守的丝苏氨酸激酶Aurora A和PLK1,对G2/M期的转化以及细胞周期的调控等都起着重要的作用。Bora是近年来发现的有丝分裂调控因子,其功能之一是作为Aurora A的结合蛋白,从而间接起到调控有丝分裂进程的作用。受精卵的第一次卵裂标志着生命的开始,然而其中的分子机制尚不明确。且受精卵第一次卵裂的进程与普通有丝分裂进程并不完全相同。Aurora A,Bora和PLK1在受精卵的第一次卵裂中的功能并未见报道有待系统研究。小鼠是与人类基因相似度极高的哺乳动物模型。此外小鼠受精卵第一次卵裂持续时程较长这一特点也为我们对受精卵第一次有丝分裂的研究提供了良好的条件。因此本研究分别对Aurora A,Bora和PLK1在受精卵1-细胞期到2-细胞期进程中的表达和定位特点及其可能存在的相互作用进行了探究。为进一步研究Aurora A,Bora和PLK1在受精卵中的功能及作用方式,叁者之间存在的相互作用及与其相关的信号通路的研究提供了基础。方法:本研究以小鼠受精卵为研究模型,通过显微注射技术将siRNA导入小鼠受精卵中从而分别敲低Aurora A,Bora和PLK1的表达水平,再通过Real-time PCR和Western-Blot技术探究正常组和敲低组受精卵中Aurora A,Bora和PLK1的表达差异,间接免疫荧光法与激光共聚焦显微镜技术检测它们的定位与共定位,统计并通过SPSS12.0软件分析其中一种基因表达下调对1-细胞期到2-细胞期卵裂进程的影响,从而探究其在小鼠受精卵第一次有丝分裂中的作用。结果:1.正常组受精卵中Aurora A和Bora的mRNA及蛋白表达水平均呈上升趋势并在M期达到峰值。2.PLK1与Aurora A在M期均定位于卵裂沟。3.通过与正常组Aurora A,Bora和PLK1的mRNA和蛋白表达水平的对比,分别验证了胞浆注射siRNA对Aurora A,Bora和PLK1的敲低效果。4.敲低Aurora A,Bora和PLK1其中一种基因的表达水平,均会影响另外两者的表达水平。5.Aurora A和PLK1敲低组进入M期后出现了Bora在细胞质的异常积累,形成了连接两个子细胞核的丝状亮带。6.Bora敲低后原本定位于细胞核内的Aurora A定位于细胞膜周围呈环状。且核区及其周围均未见分布。PLK1在G2期失去入核趋势。7.PLK1敲低后,Aurora A在G2期大量分布于细胞核内,其含量显着高于细胞质。8.敲低组受精卵出现分裂延迟,异常分裂率大大提高。结论:Aurora A、Bora、PLK1在小鼠受精卵1/2细胞期转换过程中,在M期表达最显着,叁者之间存在相互作用、相互影响关系,并参与小鼠受精卵的卵裂、纺锤体形成等功能,共同调控小鼠受精卵的早期分裂。(本文来源于《中国医科大学》期刊2018-05-01）
武迪迪[4]（2017）在《mTORC2/Akt/Girdin信号途径调控小鼠受精卵微丝聚集的研究》一文中研究指出目的:受精卵早期分裂及发育过程中微丝骨架(microf ilament cytoskeleton)对精卵融合、纺锤体旋转、分裂沟形成及胞质分裂的完成有着十分重要的作用。多项研究表明微丝骨架的形成受多种因子调控。在哺乳动物尤其在小鼠受精卵细胞的分裂及早期发育过程中,微丝骨架形成和变化的调控因子及信号调控机制尚不清楚。研究发现由mTOR(mammalian target of rapamycin)组成的mTOR/Rictor(mTORC2)复合物,即雷帕霉素不敏感复合体,与微丝骨架的建立有很大的相关性。但是mTORC2通过什么机制介导微丝骨架的聚集仍是未知。研究报道mTORC2可经Rho家族GTPases改变细胞骨架的形成。也有报道通过PKC的介导,经Rho A/ROCK的路径影响Myo I。而在中性粒细胞趋化运动中,mTORC2可以独立地调节纤维型肌动蛋白(F-actin)极化。更有一些科学家猜测mTORC2通过磷酸化Akt和PKC,把信号传递给小GTPases(Rho A、Rac1),从而实现控制肌动蛋白的组建。基于上述调控途径的诸多不明确性,mTORC2对微丝骨架聚集的信号调控途径成为研究者们追随的研究热点。而关于mTORC2在小鼠受精卵早期发育中对微丝骨架聚集及定位所发挥的作用,国内、外文献更鲜有报道。我们的前期研究发现,敲低RICTOR的表达能够影响小鼠受精卵早期的分裂。我们分析mTORC2在小鼠受精卵中的作用是参与了微丝骨架分布的调控。虽然介导微丝骨架聚集的mTORC2直接作用的靶分子还不清楚,近期涌现的研究结果显示mTORC2复合物可磷酸化Akt的Ser473位点,mTORC2能够正调控Akt蛋白。这不禁让人猜想mTORC2是经由Akt的磷酸化实现对微丝聚集的调控功能。蛋白激酶B(protein kinase B,PKB)是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶,与v-akt基因编码的Akt蛋白同源,又被称为Akt。Akt主要通过PI3K途径调节细胞多种生理功能,并被确定为参与肿瘤侵袭和转移的重要信号途径。研究报道敲低Akt表达能够抑制神经胶质瘤细胞的迁移和侵袭。Franck Vandermoere等人的研究发现Akt参与乳腺癌细胞迁移同微丝骨架的重新构建密切相关。有关Akt能否影响小鼠受精卵微丝骨架的分布,相关报道甚少。我们的前期研究发现Akt(PKB)在小鼠卵母细胞及早期受精卵中存在且能够促进受精卵的分裂。我们分析Akt可影响小鼠受精卵细胞微丝骨架的正确聚集及分布。虽有研究报道敲除Akt不影响小鼠胚胎的正常发育,我们分析认为这种情况可能是因为Akt在细胞内敲低后可被其它途径代偿。并且虽Akt敲低不影响胚胎正常发育,但是不排除异常胚胎、多倍体胚胎及多胞胎的出现。由于mTORC2最为人熟知的是他特异性地磷酸化Akt的Ser473位点并将其激活。据此我们推测mTORC2可能通过磷酸化Akt的Ser473位点改变小鼠受精卵微丝骨架的聚集。由于Akt与mTORC2密切相关性,它仍然有直接或间接地在一些细胞中通过其他一些途径实现对细胞骨架控制的可能。因有关mTORC2-Akt对微丝骨架的具体调节机制还未有定论,仍需要大量的实验阐述。Girdin(girders of actin filaments)是一个新近发现参与微丝交联的Akt底物蛋白,也被称为APE(Akt phosphorylation enhancer)、GIV(Gα-interacting vesicle associated protein)。其在多种类型癌细胞及未成熟的血管内皮细胞中表达,参与多种细胞进程,包括重新构建微丝骨架、内吞作用,最终导致癌症的侵袭和血管的再生。Girdin蛋白最早是通过酵母双杂交方法作为Akt连接蛋白而被发现的。研究显示在多种类型的生长因子刺激下,Akt能够磷酸化Girdin蛋白C-末端区域的ser-1416位点,使其在细胞迁移过程中细胞骨架的重构扮演重要角色。Girdin蛋白仅同Akt的C末端连接但是不能同其他AGC家族成员包括蛋白激酶C和SGKs相结合。表明Girdin仅参与了Akt信号途径。然而,关于Girdin蛋白在小鼠受精卵早期分裂中对微丝分布的作用及同Akt的相互关系,国内、外文献却未见报道。我们根据Scansite软件(http://scansite.mit.edu)预测了Akt和鼠Girdin蛋白的相关位点。结果发现鼠在1417位有一个丝氨酸残基而这一位点恰恰和人Girdin蛋白丝氨酸1416位点相一致。结合Girdin蛋白在小鼠受精卵中的研究空白及其在其在肿瘤细胞中的作用,进而提出假设:即Akt通过磷酸化Girdin蛋白参与调节小鼠受精卵早期发育微丝骨架的形成和分布,从而调节小鼠受精卵早期的发育。我们大胆推测Akt蛋白能够使Girdin蛋白磷酸化,磷酸化的Girdin蛋白从质膜上分离,牵引着微丝聚集在受精卵分裂处,参与形成溢缩环,并且磷酸化的Girdin蛋白同Akt结合促进Akt锚定于细胞质膜上,进而维持Akt蛋白高催化活性,促进受精卵的分裂。但是具体机制需要相应实验验证进行说明。因此,我们认为十分有必要对Girdin蛋白在小鼠受精卵微丝骨架的形成和变化中的作用及同Akt的关系进行更深一步的研究。综上所述,Akt为mTORC2的下游效应分子,而Girdin蛋白又为Akt的作用底物。如果能够证明在小鼠受精卵早期发育中mTORC2通过Akt影响微丝骨架的分布,而Akt又可通过Girdin蛋白发挥作用,再能证明mTORC2直接或间接改变Girdin蛋白的磷酸化,那么我们分析,在小鼠受精卵早期发育中,mTORC2通过Akt依赖的Girdin途径导致微丝骨架分布的改变,促进受精卵早期的发育。结合上述文献研究我们认为小鼠受精卵早期细胞分裂中微丝骨架的聚集与分布受到mTORC2/Akt/Girdin信号途径的调节并将对这一途径进行实验证明。这将为明确受精卵早期细胞的正常分裂、发育机理提供理论依据。并也对在小鼠受精卵发育早期中出现的异常胚胎现象提供一定的理论基础。方法:1、小鼠超排卵及受精卵的采集和培养2、体外转录3、显微注射与形态观察4、Western印迹法检测蛋白表达5、微丝的免疫荧光化学检测6、激光共聚焦显微镜成像分析7、数据处理结果:1、激光共聚焦显微镜观察小鼠卵母细胞及早期胚胎中发育中F-actin的分布规律采用免疫荧光技术,激光扫描共聚焦显微镜下观察并分析小鼠卵母细胞M2期、1-细胞期及2-细胞期受精卵中微丝的分布特点。结果显示F-actin在卵母细胞中靠近细胞膜下的皮层处分布。小鼠1-细胞期受精卵中分布在皮质区但更集中定位在和极体相连处。而在2-细胞胚胎中,微丝除分布于皮质区外还集中分布在卵裂球沟,参与构成缢缩环。此部分结果初步说明微丝参与了受精卵早期发育的多个过程。2、mTORC2通过改变微丝骨架构建影响小鼠受精卵早期分裂利用sh RNA沉默raptor或rictor基因的表达,观察受精卵分裂及微丝聚集改变情况。相差显微镜对发育情况进行观察发现经rictor sh RNA注射处理的小鼠受精卵发育受到阻滞,而raptor sh RNA注射组和对照组受精卵则都能顺利进入二细胞期。接下来用罗丹明标记的鬼笔环肽(TRITC-phalloidin)标记受精卵中的F-actin。激光共聚集观测结果显示同对照组相比较在rictor表达敲低的受精卵中微丝出现异常的形态,荧光信号散在分布并且在二细胞中微丝不能正确聚集在分裂沟处。观察结果说明在小鼠受精卵发育早期rictor表达敲低能够影响微丝的正确聚集。3、Akt表达及活性改变对小鼠受精卵分裂及微丝聚集状态的影响采用0.03ng编码的Akt-WT mRNA、myr-Akt mRNA、KD-Akt mRNA的及10μMAkt siRNA对小鼠一细胞期受精卵进行处理。相差显微镜观察结果显示在注射激活型Akt mRNA后小鼠受精卵的分裂率明显高于对照组,而激酶失活型及siRNA注射组小鼠受精卵的分裂率显着低于对照组。提示Akt表达及活性增强促进小鼠受精卵分裂,相反敲低Akt的表达或降低Akt的活性则抑制了小鼠受精卵的分裂。激光共聚焦显微镜观察微丝状态显示小鼠受精卵在注射野生型及持续激活型Akt的mRNA后在2-细胞的分裂沟处荧光信号明显增强,而注射Akt siRNA的受精卵的微丝不能形成正确聚集状态,细胞出现不规则分裂。4、mTORC2通过磷酸化Akt影响小鼠受精卵早期微丝的聚集采用Western blotting的方法检测经raptor/rictor敲低处理后的小鼠受精卵细胞中Akt蛋白的磷酸化情况。结果显示在对照组和注射raptor sh RNA组的小鼠受精卵中Akt蛋白在473位点磷酸化状态都显着高于rictor sh RNA处理组。说明敲低mTORC2阻止小鼠受精卵中内源性Akt蛋白的磷酸化。接下来采取rictor sh RNA和WT-Akt mRNA共注射分析小鼠受精卵微丝聚集改变情况。激光共聚焦荧光显微镜观察结果显示在单独rictor sh RNA注射组小鼠受精卵中的微丝呈弥散分布,细胞出现不对称性或不规则分裂形态。单独注射WT-Akt mRNA组小鼠受精卵中微丝荧光信号增强且集中分布在二细胞期的分裂沟处。而rictor sh RNA和myr-Akt mRNA共注射组小鼠受精卵中的微丝荧光信号减弱并成类似于单独rictor sh RNA注射组微丝分布情况。结果说明mTOR/Rictor是通过作用于小鼠受精卵内的Akt蛋白影响受精卵微丝的聚集。Akt蛋白为mTOR/Rictor的下游作用蛋白发挥作用。5、Girdin表达敲低对小鼠受精卵第一次有丝分裂及微丝状态的影响利用RNA干扰敲低小鼠受精卵中Gridin蛋白的表达。在hCG35小时通过相差显微镜对Girdin siRNA处理组和对照组进行卵裂形态观察和分裂率统计。统计结果显示同对照组相比经Girdin siRNA处理小鼠受精卵分裂率明显降低。用Girdin抗体进行免疫荧光染色显示在Girdin siRNA注射的受精卵细胞中Girdin的表达非常低。用鬼笔环肽标记F-actin显示在Gridin siRNA处理的小鼠受精卵F-actin不能正确聚集在分裂沟处,细胞呈现不对称分裂或异常分裂形态。6、Akt同Girdin蛋白的作用关系及小鼠受精卵中Akt及Girdin蛋白对微丝聚集的调控根据Scansite软件(http://scansite.mit.edu)预测了Akt和鼠Girdin蛋白的相关位点。我们发现鼠在1417位有一个丝氨酸残基而这一位点恰恰和人Girdin蛋白丝氨酸1416位点相一致。通过取小鼠G1期受精卵显微注射野生型和持续激活型Akt的mRNA或利用siRNA沉默Akt蛋白编码基因,免疫印迹检测Girdin的1417位磷酸化及Girdin蛋白的总表达情况。结果显示野生型和持续激活型Akt的mRNA注射组Girdin的ser1417位磷酸化增强但是并不影响Girdin蛋白的总的表达。siRNA介导的Akt表达敲除非常明显的降低了Girdin的磷酸化水平。然而,敲除Girdin蛋白并不能影响Akt的磷酸化。上述结果说明在小鼠受精卵中Akt可磷酸化Girdin蛋白的Ser1417位。接下来通过激光共聚焦显微镜观察经持续激活型Akt mRNA、野生型Akt mRNA、激酶失活型Akt mRNA及Akt siRNA处理后小鼠受精卵中Girdin1417及F-actin的定位状态。结果显示对照组中Girdin1417弥散分布在胞浆中,而经持续激活型Akt mRNA、野生型Akt mRNA处理后的小鼠受精卵中FITC标记的Girdin-1417荧光信号较对照组及Akt siRNA处理组明显增强,并且观察发现微丝的荧光信号在分裂沟处增强,分布位置也更加集中在2-细胞期小鼠受精卵的分裂沟处,这也说明磷酸化的Girdin蛋白可能参与了微丝的正确聚集。接下来先用Akt-WT mRNA或myr-Akt mRNA处理小鼠G1期受精卵培养2小时后再进行Girdin siRNA注射处理。通过激光共聚集荧光显微镜观察每一组卵细胞的F-actin聚集状态。在Akt mRNA和Girdin siRNA共注射组F-actin荧光信号出现了明显的下降,微丝正确聚集收到干扰。这同单独注射Girdin siRNA组出现的结果相一致。说明Akt可能通过作用Girdin蛋白影响微丝聚集。7、mTORC2影响Girdin蛋白的磷酸化采用Western blotting方法检测经raptor/rictor敲低处理后的小鼠受精卵细胞中Girdin蛋白1417位点的磷酸化情况。结果显示在对照组的小鼠受精卵中Girdin蛋白在1417位点是呈磷酸化状态。而rictor sh RNA处理组检测不到Gridin蛋白的磷酸化。注射raptor sh RNA组Girdin的磷酸化状态同对照组相似。因此我们认为敲低mTORC2阻止了Girdin蛋白的磷酸化。8、mTORC2通过作用Akt蛋白影响Girdin蛋白的磷酸化为明确Akt在mTORC2影响Girdin蛋白磷酸化中的作用,实验中取小鼠G1期受精卵先显微注射rictor sh RNA或raptor sh RNA然后移入M16中培养2小时后再显微注射myr-Akt mRNA培养20小时后,收集受精卵细胞用免疫印迹法检测Girdin蛋白的磷酸化。蛋白免疫结果显示同对照组及单独注射rictor sh RNA组相比较rictor sh RNA和myr-Akt mRNA共注射组的Girdin蛋白磷酸化明显降低。而单独注射myr-Akt mRNA组Girdin蛋白的磷酸化是增强的。结果说明Akt参与了mTORC2对Girdin蛋白的磷酸化调节。结论:1、mTORC2、Akt、Girdin通过改变微丝的聚集影响小鼠受精卵早期分裂。2、Akt通过磷酸化Girdin蛋白的1417位,影响小鼠受精卵微丝的聚集。3、mTORC2通过磷酸化Akt影响Girdin蛋白的磷酸化,改变小鼠受精卵微丝的聚集。(本文来源于《中国医科大学》期刊2017-03-01）
张苎兮[5]（2017）在《蛋白激酶Pkmyt1与RASAL2互作及其对小鼠受精卵早期发育的影响》一文中研究指出目的验证蛋白激酶Pkmyt1与RASAL2在小鼠1-细胞期受精卵存在相互作用,进而研究其对小鼠1-细胞期受精卵发育的影响,为探讨蛋白激酶Pkmyt1对哺乳动物胚胎早期发育调控的机制奠定基础。方法1、利用免疫共沉淀方法验证蛋白激酶Pkmyt1与RASAL2在细胞内存在相互作用。2、利用GST pull down方法验证蛋白激酶Pkmyt1与RASAL2间在体外存在相互作用。3、免疫荧光实验观察蛋白激酶Pkmyt1与RASAL2蛋白在小鼠1-细胞期受精卵的共定位情况。4、Real-time PCR检测小鼠1-细胞期受精卵中RASAL2 mRNA的表达水平。5、免疫荧光实验观察RASAL2在小鼠1-细胞期受精卵中的定位情况。6、显微注射RASAL2-mRNA,观察其对小鼠1-细胞期受精卵卵裂率的影响。结果1、免疫共沉淀结果证实蛋白激酶Pkmyt1与RASAL2在细胞内存在相互作用。2、GST pull down结果证实蛋白激酶Pkmyt1与RASAL2在体外存在相互作用。3、免疫荧光观察到蛋白激酶Pkmyt1与RASAL2在小鼠1-细胞期受精卵中存在共定位。4、Real-time PCR检测到RASAL2 mRNA在小鼠1-细胞期受精卵各个时期均有表达,在S期表达增多,G2期表达开始减少。5、免疫荧光结果观察到RASAL2在小鼠1-细胞期受精卵中主要表达在细胞浆中,M期在细胞浆和细胞核中均有表达。6、过表达RASAL2抑制小鼠1-细胞期受精卵卵裂。结论本研究证实蛋白激酶Pkmyt1与RASAL2存在相互作用,且在小鼠1-细胞期受精卵中存在共定位。RASAL2的mRNA在小鼠1-细胞期受精卵各个时期动态表达,且过表达RASAL2抑制小鼠1-细胞期受精卵卵裂,提示在小鼠受精卵中蛋白激酶Pkmyt1可能通过与RASAL2相互作用进而调控小鼠受精卵早期发育。(本文来源于《锦州医科大学》期刊2017-03-01）
韦剑辉[6]（2016）在《小鼠受精卵显微注射技术的优化以及Trex1敲除小鼠的构建》一文中研究指出显微注射技术是转基因动物模型制备的主要辅助手段之一,通过这种方法来制备转基因小鼠的成功率受到很多因素的影响。Trex1是哺乳动物细胞中主要的3'端DNA核酸外切酶,即使在正常的情况下动物体内会不断地有大量细胞受损或死亡,这些细胞会释放出DNA,人类如果存在Trex1基因的突变,就会导致DNA的大量堆积,诱发先天免疫系统识别并清除这些来自生物自身的DNA,这样就有可能产生自身免疫疾病,如Aicardi-Goutieres综合征或者系统性红斑狼疮(systemic lupus erythematosus,SLE)等自身免疫疾病的产生。运用基因编辑技术对模式动物进行Trexl基因的敲除,就有可能构建出呈现自身免疫疾特征地病动物模型,从而探索相关疾病的发生、发展,这对我们了解这些疾病的发病机理并进一步探索疾病的诊断和治疗提供很多有用的数据和理论依据。在本课题中,我们成功的构建了叁种针对Trex1基因的敲除质粒,并且在L929细胞中验证了这些质粒的有效性,验证结果显示叁种敲除质粒全部有效。在得到有效的敲除质粒以后,我们开始对利用px459-sg1-Trex1敲除质粒及其转录的sg1RNA、 cas9mRNA以及cas9蛋白质对小鼠受精卵显微注射技术进行优化。我们对供体小鼠的周龄、受精卵接受显微注射的部位、注射的内容物和注射液浓度这四个因素进行了探索,经过探索后得到的结论是,采用4.5周龄供体小鼠提供的受精卵进行显微注射是最好的,并且在注射的过程中,在原核部位注射Cas9mRNA/sg1mRNA注射浓度为50/25(ng/μl)时获得Trex1转基因小鼠的概率最高。在技术优化的过程中,我们得到了140只新生小鼠,对这些新生小鼠进行基因型鉴定后,发现有1只纯合的Trex1敲除小鼠,38只杂合小鼠,101只野生型小鼠。通过对这叁种小鼠的生理生化指标进行分析,发现Trex1-/-的脾脏尺寸相对于Trex1+/+、Trex1+/-两种小鼠而言更大,且WB结果显示Trex1+/+、Trex1+/-两种小鼠的脾脏存在Trex1的表达,而Trex1-/-小鼠则不表达,表示其可能已经表现出因为Trex1基因缺失而导致的自身免疫疾病相关生理生化指标的变化,从而导致脾脏肿大。这表明我们已经成功的运用小鼠显微注射技术和CRISPR/Cas9技术构建了Trex1敲除小鼠,为进一步研究Trex1调节相关自身免疫机制提供了重要的基础。(本文来源于《福建师范大学》期刊2016-06-05）
苏忆非[7]（2016）在《小鼠受精卵模拟微重力差异基因的验证及Ndufa4对其体外发育的影响》一文中研究指出本实验室利用转臂式生物反应器(RWVB)所产生的模拟微重力环境对小鼠受精卵进行体外培养,以平面培养作为对照,观察模拟微重力环境对小鼠受精卵的影响情况。通过单细胞测序发现C57小鼠受精卵在hCG 20h、hCG后20h平面培养9h与hCG后20h微重力培养9h存在7个差异基因。本实验以昆明小鼠为研究对象,通过Q-PCR方法验证这七个差异基因:Tmem59、Teddm1b、1600010M07Rik、Lars2、Ndufa4、Nts和Papolog的相对表达情况,与单细胞测序结果进行比较计算准确率。挑选出差异基因Ndufa4,通过Q-PCR、构建载体、干扰、显微注射等方法研究Ndufa4的功能机制。以hCG 20h为对照组(A组)、继续平面培养9h(D组)、继续微重力培养条件下培养9h(E组)。本实验室党楠楠通过单细胞测序发现:D与E组表达差异1.5倍以上的基因共7个。本实验通过Q-PCR方法在昆明小鼠受精卵对Tmem59、Teddm1b、1600010M07Rik、Lars2、Ndufa4、Nts和Papolog这七个单细胞测序结果验证发现:这七个基因在D组与E组相对表达量显着差异的基因有Lars2、Tmem59、Ndufa4和1600010M07Rik;D组与E组相对表达量显着不差异的基因为Papolg与Nts;而Teddm1b基因则由于表达量过低未检测出。单细胞测序结果验证结果准确率为66.7%。初步筛选出Ndufa4基因,以hCG后20 h时雌雄原核均出现的状态作为受精标志,构建Ndufa4的表达载体与干扰SiRNA,通过显微注射观察对受精卵的发育影响。结果显示:显微注射后小鼠受精卵囊胚率显着降低。以hCG 20h后显微注射水为对照,显微注射pEGFP-Ndufa4表达载体为实验组,通过Q-PCR检测Bcl家族Bax、Bak、Bcl-xl和Bcl-2基因(其中Bax、Bak为促凋亡基因,Bcl-xl与Bcl-2为抑凋亡基因)的相对表达量。结果表明:过表达Ndufa4基因会使小鼠Bax与Bak显着升高;引起细胞线粒体凋亡的蛋白cyt C的相对表达量也显着升高。以hCG 20h后显微注射水为对照,显微注射Ndufa4的SiRNA为实验组,通过Q-PCR检测Bcl家族Bax、Bak、Bcl-xl和Bcl-2基因(其中Bax、Bak为促凋亡基因,Bcl-xl与Bcl-2为抑凋亡基因)的相对表达量。结果表明:干扰小鼠Ndufa4基因的表达会导致Bax的相对表达量显着升高;cytC的相对表达量也显着升高。Ndufa4的过表达或者干扰均可能会影响凋亡因子的表达,最终导致受精卵凋亡。(本文来源于《华南农业大学》期刊2016-06-01）
郎伍营[8]（2016）在《小鼠体外受精条件优化及活性氧对体外受精卵发育的影响》一文中研究指出体外受精技术对于一些濒危动物和优良家畜品种的后代续繁、国际品种交流、品种资源保存有重大意义,其最大优点是能够打破时间和空间限制。但体外受精率依就偏低,因此本实验目的是通过优化体外受精条件提高体外受精发育率。实验通过对采卵时间、精子获能时间和精卵共孵育时间叁个方面进行条件优化并且采用DCFDA染色检测ROS水平以及免疫荧光检测FOXO3a的表达来研究活性氧对胚胎的作用原理。研究结果表明采卵时间为13h、精子获能时间1.5h、精卵共孵育时间6h时,小鼠体外受精结果最好；H202处理后胚胎各阶段FOXO3a表达量均显着高于对照组。综上所述通过对采卵时间、精子获能时间和精卵共孵育时间的优化达到了提高体外受精率的目的,并且通过对FoXO3a蛋白含量的检测进一步说明FoXO3a参与了氧化应激反应。(本文来源于《延边大学》期刊2016-05-24）
武迪迪,张盼盼,刘莹,于秉治[9]（2016）在《PKB/Akt通过Girdin蛋白调控小鼠受精卵微丝聚集》一文中研究指出通过研究PKB/Akt与Girdin蛋白之间的关系,目的在于揭示Girdin蛋白在PKB/Akt调控小鼠受精卵微丝聚集中的作用。研究中首先结合软件(http://scansite.mit.edu//)预测了PKB/Akt对Girdin蛋白的磷酸化位点,并制定特定位点磷酸化抗体,通过蛋白免疫印迹检测经PKB/Akt m RNA或PKB/Akt si RNA处理后的小鼠受精卵中Girdin蛋白磷酸化改变情况。同时检测了磷酸化的Girdin蛋白亚细胞定位及同微丝骨架的定位关系。进一步通过显微注射PKB/Akt m RNA再注射Girdin si RNA检测小鼠受精卵微丝骨架的聚集。结果显示经持续激活型PKB/Akt m RNA、野生型PKB/Akt m RNA处理后的小鼠受精卵中p-Girdin-1 417分布位置更加集中在2-细胞分裂沟处。经野生型和持续激活型PKB/Aktm RNA注射组p-Girdin-1 417表达增强,但是并不影响Girdin蛋白的总的表达。说明si RNA介导的PKB/Akt表达敲低非常明显地降低了Girdin蛋白的磷酸化。激光共聚焦研究显示在Akt m RNA和Girdin si RNA共注射组微丝骨架分布明显散乱。本研究结果充分说明Girdin蛋白在小鼠受精卵中受到PKB/Akt的调节,PKB/Akt通过磷酸化Girdin蛋白改变微丝骨架的聚集。(本文来源于《生物工程学报》期刊2016年09期）
武迪迪,张盼盼,刘莹,于秉治[10]（2016）在《Girdin蛋白在小鼠受精卵微丝聚集调控作用的初步研究》一文中研究指出目的:探讨Girdin蛋白在调控小鼠受精卵早期发育微丝聚集中的作用。方法:采用免疫荧光染色观察Girdin蛋白和F-actin在小鼠受精卵中的共定位情况。激光共聚焦显微镜观察Girdin表达敲低后小鼠受精卵分裂形态及分裂率。结果:在小鼠受精卵中存在Girdin蛋白并且Girdin蛋白与F-actin存在共定位。敲低Girdin蛋白的表达,小鼠受精卵出现不规则分裂,10μmol/L Girdin si RNA处理组小鼠受精卵有28.93%到达2-细胞期,而注射20μmol/L Girdin si RNA组小鼠受精卵只有15.1%到达2-细胞期。并且Girdin表达敲低的受精卵微丝不能正确聚集。结论:Girdin蛋白在调控小鼠受精卵早期分裂微丝聚集中发挥作用。(本文来源于《生殖与避孕》期刊2016年04期）
小鼠受精卵论文开题报告
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
目的研究脯氨酸丰富的肌醇多磷酸5磷酸酶(PIPP)在小鼠1-细胞期胚胎中的定位以及它对Cdc2在Tyr15位点磷酸化的调节作用。方法提取质粒、酶切鉴定并转染PEFBOS PIPP质粒以及空载体PEFBOS vector到小鼠受精卵,用免疫荧光染色检测PIPP的定位,Western blot检测PIPP对Cdc2在Tyr15位点磷酸化的影响。结果PIPP的定位在小鼠受精卵有丝分裂过程中不断变化,并且PIPP在小鼠受精卵中的过度表达增加了Cdc2在Tyr15位点的磷酸化。结论 PIPP存在于小鼠受精卵中并通过调节Cdc2的磷酸化参与小鼠受精卵的有丝分裂过程。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
小鼠受精卵论文参考文献
[1].刘艳春.PKCδ/Cdc25B通路对小鼠受精卵早期发育调控机制的研究[D].中国医科大学.2018
[2].李森,王洋,郑晓娇,刘玲玲,冯晨.肌醇多磷酸5磷酸酶PIPP在小鼠受精卵内对细胞周期蛋白Cdc2的影响[J].解剖科学进展.2018
[3].王美娇.AuroraA/Bora,PLK1在小鼠受精卵有丝分裂中功能的研究[D].中国医科大学.2018
[4].武迪迪.mTORC2/Akt/Girdin信号途径调控小鼠受精卵微丝聚集的研究[D].中国医科大学.2017
[5].张苎兮.蛋白激酶Pkmyt1与RASAL2互作及其对小鼠受精卵早期发育的影响[D].锦州医科大学.2017
[6].韦剑辉.小鼠受精卵显微注射技术的优化以及Trex1敲除小鼠的构建[D].福建师范大学.2016
[7].苏忆非.小鼠受精卵模拟微重力差异基因的验证及Ndufa4对其体外发育的影响[D].华南农业大学.2016
[8].郎伍营.小鼠体外受精条件优化及活性氧对体外受精卵发育的影响[D].延边大学.2016
[9].武迪迪,张盼盼,刘莹,于秉治.PKB/Akt通过Girdin蛋白调控小鼠受精卵微丝聚集[J].生物工程学报.2016
[10].武迪迪,张盼盼,刘莹,于秉治.Girdin蛋白在小鼠受精卵微丝聚集调控作用的初步研究[J].生殖与避孕.2016
论文知识图
![孤雌单倍体胚胎干细胞的建系流程[66]](/uploads/article/2020/01/06/b30d1949af9d845fae85812d.jpg)
