桑黄HMGS基因克隆、分子特性及差异表达分析

论文摘要

目的对参与桑黄三萜合成途径的关键酶羟甲基戊二酰辅酶A合酶（3-hydroxy-3-methylglutaryCoAsynthase,HMGS）进行基因全长克隆、分子特性及差异表达分析研究。方法采用RACE技术克隆HMGS基因全长,并对其序列进行生物信息学分析;构建桑黄HMGS基因到表达载体pET-32a （+）上,转化大肠杆菌BL21 （DE3）,IPTG诱导表达后SDS-PAGE检测;用荧光定量PCR的方法分析其不同发育阶段表达特性。结果 HMGS基因cDNA全长为1 930 bp,包含1个1 458 bp的完整开放阅读框,编码485个氨基酸。该基因编码蛋白的相对分子质量约为52 750,理论等电点是5.60,为亲水性蛋白,不具有跨膜结构,不含信号肽序列;系统发育分析表明,桑黄HMGS与地中海拟层孔菌Fomitiporia mediterranea中的HMGS同源性最高,属于一个分支。SDS-PAGE结果显示该蛋白的大小与预测的蛋白相对分子质量基本一致。HMGS基因的转录水平在桑黄不同发育阶段呈动态变化,该基因在菌丝体阶段的转录水平要高于原基及子实体阶段的转录水平。HMGS基因的最高转录水平出现在第14天,为对照第5天的2.33倍。结论 HMGS基因的分子鉴定为进一步解析该基因在桑黄三萜类物质合成代谢途径中的分子调控作用奠定基础。

论文目录

• 1 材料与试剂
•   1.1 材料
•   1.2 试剂
• 2 方法
•   2.1 桑黄总RNA提取
•   2.2 桑黄HMGS基因片段的克隆
•   2.3 3’RACE和5’RACE的扩增
•   2.4 桑黄HMGS基因全长cDNA的克隆
•   2.5 生物信息学分析
•   2.6 桑黄HMGS基因原核表达
•     2.6.1 重组质粒pMD18-T-HMGS的构建
•     2.6.2 桑黄HMGS基因原核表达载体的构建
•     2.6.3 重组载体的诱导表达
•   2.7 HMGS基因在不同发育阶段的表达特性分析
•     2.7.1桑黄菌丝体的发酵培养
•     2.7.2 桑黄原种及栽培种培养
•     2.7.3 实时荧光定量PCR反应
• 3 结果与分析
•   3.1 总RNA的提取及检测
•   3.2 HMGS基因片段的获得
•   3.3 RACE和HMGS全长cDNA序列分析
•   3.4 HMGS基因全长序列生物信息学分析
•     3.4.1 理化性质分析
•     3.4.2蛋白质二级、三级结构的预测
•     3.4.3 HMGS氨基酸序列的系统进化分析
•   3.5 桑黄HMGS基因原核表达载体的诱导表达
•   3.6 HMGS基因在不同发育阶段的表达分析
• 4 讨论

文章来源

类型: 期刊论文

作者: 孙婷婷,刘增才,王世新,王旭彤,邹莉

关键词: 桑黄,基因,三萜化合物,表达分析

来源: 中草药 2019年23期

年度: 2019

分类: 医药卫生科技,农业科技

专业: 农作物

单位: 哈尔滨学院食品工程学院,东北林业大学林学院

基金: 哈尔滨学院青年博士科研启动基金项目（HUDF2018105）

分类号: S567.3

页码: 5823-5829

总页数: 7

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