一、持续高+G_x对猴肺组织病理学影响的初步观察（论文文献综述）
王延蛟[1]（2021）在《mRNA/piRNA/piwi在DEN诱导肝癌中的表达及紫草素对肝癌细胞生物学行为的影响》文中指出目的:全球肝癌发病率和死亡率居高不下,每年约有841,000新发病例和782,000死亡病例,其中约50%来自中国,严重威胁到人类的健康。寻找肝癌潜在发病机制及诱发因素,能早发现、早治疗的任务迫在眉睫。DEN（Diethylnitrosamine,二乙基亚硝胺）诱发癌变过程与人肝癌的过程非常相似,是最广泛应用的肝癌模型。而肝癌的发生和发展是一个复杂的多因素过程,涉及细胞和分子水平的异常变化,关于肝癌发病机制的研究主要集中在细胞信号转导、肿瘤相关基因表达调控等方面。基因芯片能对基因表达的组织特异性、病变特异性进行综合的分析和判断,并迅速将基因与疾病联系起来。mi RNA虽然与肝癌的发生密切相关,但其无明显的细胞特异性,而存在于生殖细胞piwi蛋白具有组织特异性,近年被发现也存在于癌细胞,与piwi蛋白结合的piRNA（Piwi-interacting RNA）在维持DNA完整、抑制转录、翻译等均有重要作用,但关于piRNA/piwi与肿瘤发生的相关研究还在初始阶段。肝癌化疗失败的主要原因是多重耐药性（multi-drug resistance,MDR）,研究表明紫草素具有抗癌作用,不易产生耐药性且副作用小,但具体机制并不清楚。综上所述,本研究以DEN诱导建立的大鼠肝癌模型作为研究对象,测定血清肝癌标志物、免疫、内分泌及相关指标,寻找肝组织差异表达的mRNA和piRNA及相关蛋白,揭示以上因素与肝癌发生发展的关系;以肝癌细胞CBRH-7919为研究对象,检测紫草素对其增殖、凋亡、迁移及侵袭的影响,为探索肝癌发生的分子机制及临床用药提供理论支持。方法:1)选取40只6周龄雄性健康Wistar大鼠,重量在150克左右,分为肝癌模型组（NC）和正常对照组（Md）,其中,肝癌模型组自由饮用浓度为0.1 mg/m L DEN的无菌水,每24小时更换一次,20周后停药（9-12周断药用水代替）,观察肝脏组织病理形态学的改变以及细胞超微结构的变化;ELISA法检测外周血AFP、ASMA、HSP、IL-1、IL-6、TNF-α、ACTH、CORT等指标的改变;利用芯片技术检测组间肝组织mRNA的差异表达并筛选候选基因,采用RT-q PCR、免疫组织化学、Western-blot检测肝癌组织中候选基因的mRNA和蛋白质的表达水平;2)利用二代测序法检测肝组织差异表达的piRNA;利用motif短序列模式比配算法辨认piRNA临近调控区域加工区域特征进行富集度解析和聚类,结合piRNA定位进行功能基因的分布总结,利用RT-q PCR对piRNA、mi RNA进行定量,通过免疫组化和Western-blot检测肝组织中piwil2、piwil4等基因蛋白质的表达水平,利用CRISPR/cas9基因编辑系统敲除CBRH-7919细胞中的piwil4基因,利用CCK-8、流式细胞术、划痕实验检测细胞的增殖、凋亡及迁移的变化;3)用MTT、流式细胞术、划痕实验以及transwell小室法观察紫草素作用于CBRH-7919细胞后的细胞增殖、凋亡、迁移及侵袭等变化,通过Western Blot法检测紫草素作用CBRH-7919细胞后STAT3、Cyclin D1、piwil4、Bcl-xl蛋白。结果:1)利用改变饮水方式建立了DEN诱导大鼠肝癌模型,成癌率为75%,并避免了实验动物中途死亡,肝癌组肝脏表面粗糙度增加,假小叶、增生灶和大量癌结节形成。与正常对照组比较,肝癌模型组血清AFP明显升高,差异显着（P<0.01）;组间血清ASMA无统计学差异,肝癌模型组与正常对照组血清HSP差异显着（P<0.01）。血清免疫学指标IL-1、IL-6水平降低而TNF-α水平升高（P<0.05）,内分泌指标ACTH和CORT的水平降低。mRNA芯片结果显示,31042个mRNA中表达上调的有1639个,表达下调的有360个,应用RT-q PCR法检测结果发现,STAT3和Cyclin D1基因的mRNA表达水平显着升高（P<0.01）;Igfals、G6PC基因的mRNA表达水平下调,有统计学差异（P<0.05）;免疫组织化学结果显示,正常对照组中STAT3和Cyclin D1蛋白表达量少,肝癌模型组STAT3和Cyclin D1蛋白的高表达主要定位在细胞核。western-blot实验结果显示Igfals、G6PC以及Emp1蛋白表达水平下调,有统计学差异（P<0.05）;2)总计发现符合piRNA序列特征的为27439个,mRNA芯片结果显示,与正常对照组相比发现,肝癌模型组中上调表达的piRNA有4个（P<0.05）,分别是piR-64745（piR-rno-51044）,piR-64265（piR-rno-50623）,piR-79437（piR-rno-48177）,piR-64744（piR-rno-51043）,表达下调的有2个（P<0.01）,分别是piR-64143（piR-rno-50518）和piR-64142（piR-rno-50517）。组间表达异常的piRNA靶基因涉及嘌呤嘧啶代谢、氨基酸降解、黏多糖合成、复制、DNA剪切与修复、RNA和蛋白质降解、MAPK信号通路、Ras信号通路众多途径,RT-q PCR显示,与正常对照组比较,肝癌模型肝组织的piR-79437表达增加（P<0.01）、piR-64143表达降低（P<0.01）,肝癌模型组血清中mi R-133b升高（P<0.05）;在肝癌模型肝脏中Piwil2、Piwil4的蛋白高表达（P<0.01）,Piwil4基因敲除后,与肝癌正常对照组和空载组相比,KO组细胞的增殖活性降低（P<0.05）,KO组细胞凋亡率明显增加（P<0.05）,Piwil4-/-细胞中STAT3、Cyclin D1、Bcl-x L蛋白表达水平均下调,差异显着（P<0.05）;3)紫草素的IC50是11.97μM,作用细胞的浓度确定为5、10、15μM,细胞的存活率随药物浓度的增加而发生梯度变化,具有统计学差异（P<0.05）,FCM结果显示,紫草素浓度为0μM、5μM、10μM、15μM时候,凋亡细胞数量分别为5.50±0.28%、7.88±0.51%、16.05±1.23%、26.88±0.22%,细胞凋亡率逐步上升,呈现出浓度依赖性,具有统计学差异（P<0.05）,划痕实验结果显示,依次用0μM、5μM、10μM、15μM的紫草素对应的迁移率分别为52.10±6.12%、47.01±9.01%、34.11±7.18%、13.98±4.52%,呈现出浓度依赖性,具有统计学差异（P<0.05）;transwell实验显示,依次用0μM、5μM、10μM、15μM的紫草素对应穿过小室膜的细胞数分别为482.33±55.54%、423.00±35.51%、386.33±68.37%、288.67±50.74%,呈现出浓度依赖性,侵袭能力下降,具有统计学差异（P<0.05）;用15μM紫草素处理CBRH-7919细胞48小时后,STAT3、Cyclin D1蛋白表达下调（P<0.05）,piwil4和Bcl-x L与正常对照组无明显变化。结论:1)使用0.1mg/ml的DEN饮用水诱导大鼠肝癌模型20周（9-12周停药）,成癌率为75%（15/20）,效果良好,观察肝脏组织HE病理结果发现肝癌发生,且血清AFP、HSP均升高,是一种较理想的研究肝癌发生发展的大鼠模型。作者认为免疫相关IL-1、IL-6、TNF-α水平的升高,内分泌相关ACTH和CORT水平的降低,提示肝癌模型中免疫和内分泌功能至少在一定程度上发生紊乱;2)模型肝脏中,STAT3,Cyclin D1等癌基因的过表达和促凋亡基因EMP1低表达共同导致细胞的持续增殖,肝癌模型的G6PC表达的降低便于糖异生的中间产物用于肝癌细胞增殖所需能量的供应和物质的生物合成;3)本研究发现piR-79437、piR-64143的异常表达可能与HCC存在关联,在肝癌的发生和发展中起作用,血清mi R-133b可能是肝癌的潜在标志物,PIWIL2和PIWIL4在肝癌模型组的高表达,提示具有促癌作用,PIWIL4基因敲除细胞中STAT3,cyclin D1和Bcl-xl的表达水平低于对照组,表明PIWIL4基因可能通过作用于STAT3/cyclin D1促进肝癌细胞的增殖,通过STAT3/Bcl-x L抑制其凋亡;4)紫草素使STAT3和Cyclin D1蛋白表达下调,提示其对肝癌细胞生长有抑制作用,同时,紫草素可以促进肝癌细胞的凋亡,抑制其迁移及侵袭,呈现浓度依赖性的关系,但其作用细胞后的piwil4和Bcl-x L的表达水平没有变化,提示紫草素不通过Bcl-x L影响细胞凋亡,具体通过什么途径促进肝癌细胞的凋亡,还需进一步研究。
张涵茵[2]（2021）在《低氧诱导因子-1α在糖尿病小鼠肺炎克雷伯杆菌肺炎中的作用及机制研究》文中提出目的:临床研究显示糖尿病是革兰阴性杆菌感染的独立易感因素,同时糖尿病患者合并感染时临床表现更重,住院时间更长,住院花费更高,但其加重的原因和机制尚不清楚。以往的研究证实肺部感染时,感染组织局部会出现缺氧微环境。低氧诱导因子-1α（HIF-1α）是一种低氧反应元件,在细胞组织氧浓度下降时激活,并激活一系列下游分子的转录及表达,既往研究表明HIF-1α参与感染的发生与发展。本研究通过观察在糖尿病小鼠肺炎克雷伯杆菌（Klebsiella pneumoniae,K.P）肺炎中HIF-1α的水平变化在感染中的作用并探讨其机制,明确HIF-1α在糖尿病小鼠肺炎克雷伯杆菌肺炎中的作用。研究方法:1.探究糖尿病合并肺炎克雷伯杆菌肺炎的感染特点以及HIF-1α的表达情况将180只8周龄雄性C57bl/6小鼠（SPF级）随机分为:正常对照组、糖尿病非感染组、非糖尿病感染组,糖尿病感染组。对糖尿病非感染组和糖尿病感染组一次性空腹腹腔注射链脲佐菌素（STZ）150mg/kg进行糖尿病造模。利用无创气管插管技术,向非糖尿病感染组和糖尿病感染组接种K.P悬浊液20μl进行肺炎造模,向正常对照组及糖尿病非感染组接种等量无菌PBS。于0h（接种前）及接种后的2h,8h,12h,24h,2天,4天,5天,7天,通过小鼠一般状态、动物行为学指标、生存率、肺组织重量及病理、肺组织及脾组织细菌载量、血清细胞因子、肺泡灌洗液（BALF）细胞因子来评价感染和炎症反应。通过免疫印迹技术及免疫组织化学法对肺组织HIF-1α水平检测,比较四组之间上述指标差别。选取各组中24h时间点的小鼠（肺组织炎症反应最重）,流式细胞学检测小鼠BALF中巨噬细胞所占比例。2.HIF-1α在糖尿病小鼠合并肺炎克雷伯杆菌肺炎中的作用及可能机制探讨为明确HIF-1α作用,选取动物实验常用HIF-1α水解酶抑制剂二甲基草酰甘氨酸（DMOG）来明确抑制HIF-1α水解酶后对感染的影响。考虑到目前已上市的临床药物HIF-1α水解酶抑制剂罗沙司他（FG4592）所以单独设置一组动物应用罗沙司他,观察其对肺炎的影响。将270只8周龄雄性C57bl/6小鼠（SPF级）随机分为:正常对照组、糖尿病非感染组、非糖尿病感染组、糖尿病感染组,糖尿病DMOG感染组,糖尿病FG4592感染组。于感染前5天分别对糖尿病DMOG感染组和糖尿病FG4592感染组每两天一次腹腔注射DMOG（30mg/kg）和FG4592（10mg/kg）直至取材,其余模型建立同前。通过小鼠一般状态、动物行为学指标、生存率、肺组织重量及病理、肺组织及脾组织细菌载量、血清细胞因子、BALF细胞因子来评价感染和炎症反应。通过免疫印迹技术及免疫组织化学法对肺组织HIF-1α水平检测,比较各组之间上述指标差别。3.高糖低氧环境对小鼠巨噬细胞功能及细胞内HIF-1α的影响的初步研究选取小鼠单核巨噬细胞（RAW264.7）检测其对K.P清除能力。为衡量高糖对清除能力的影响,设置正常糖5.5m M和高糖30m M两个糖浓度,并分别加入200μM的DMOG、50μM的FG4592,24小时后加入K.P与细胞100:1共培养,本实验分为:5.5m M-K.P组、30m M-K.P组,30m M-K.P-DMOG组,30m M-K.P-FG4592组。随后进行菌落培养计数,比较各组巨噬细胞的清除能力。为衡量高糖及低氧对RAW264.7细胞HIF-1α水平的影响,对RAW264.7细胞进行低氧刺激（37℃、5%CO2、1%O2,6小时）。并加入200μM的DMOG、50μM的FG4592。为在体外模拟肺炎,加入K.P脂多糖（LPS,100ng/ml,24小时）。本实验分为:常氧正常糖组（N5）、低氧正常糖组（H5）、常氧高糖组（N30）、低氧高糖组（H30）、低氧高糖DMOG组（H30-DMOG）,低氧高糖FG4592组（H30-FG4592）,低氧正常糖LPS组（H5-LPS）、低氧高糖LPS组（H30-LPS）。通过免疫印迹技术进行HIF-1α水平检测。为衡量在体外高糖对肺炎时RAW264.7细胞增殖水平的影响,设置5.5m M和30m M两个糖浓度,并加入LPS模拟肺炎。分组:正常糖组（N5）、高糖组（N30）、正常糖LPS（N5-LPS）组、高糖LPS（N30-LPS）组、高糖DMOG-LPS组（N30-DMOG-LPS）。通过5-溴脱氧尿嘧啶核苷（Brd U）标记法进行细胞增殖能力检测。结果:1.糖尿病合并肺炎克雷伯杆菌肺炎的感染特点以及HIF-1α的表达情况1.1一般状态与生存率:相比糖尿病非感染组,糖尿病感染组小鼠活动量、食欲及体重明显减少（P<0.05）。仅糖尿病感染组出现眼角脓性分泌物、鼻流清涕等症状,其余三组无上述变化。糖尿病感染组2小时即出现死亡,非糖尿病感染组12小时起出现死亡。在7天的观察期结束时,糖尿病感染组生存率（67%）明显低于非糖尿病感染组（89%,P<0.05）。糖尿病非感染组和正常对照组均未出现死亡。1.2肺组织病理表现:相比正常对照组,糖尿病非感染组肺组织重量较轻（P<0.05）。相比非糖尿病感染组,糖尿病组感染组肺组织可见病变肺叶肿大更严重,质地变实范围更大,肺组织重量更重（P<0.01）。1.3石蜡切片HE染色光镜下表现:相比非糖尿病感染组,糖尿病组感染组光镜下可见更严重的毛细血管扩张和炎性细胞浸润及肺泡单位结构破坏,炎症细胞浸润程度评分显示,糖尿病感染组和非糖尿病感染组在感染后均迅速出现炎症浸润,糖尿病感染组在感染后约12小时至第4天炎症反应明显更重（P<0.05）。1.4 BALF细胞因子:相比正常对照组,糖尿病非感染组肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白介素-6（IL-6）均有升高（P<0.01）。相比非糖尿病感染组,糖尿病感染组小鼠的TNF-α显着升高（P<0.01）。1.5血清细胞因子:相比正常对照组,糖尿病非感染组TNF-α、IL-6均有升高（P<0.01）。相比非糖尿病感染组,糖尿病感染组TNF-α、IL-6均有显着升高（P<0.01）。1.6血清降钙素原（PCT）:相比正常对照组,糖尿病非感染组PCT升高（P<0.01）。相比非糖尿病感染组,糖尿病感染组PCT显着升高（P<0.01）1.7肺和脾组织匀浆菌落计数:相比非糖尿病感染组,糖尿病感染组肺组织全病程载菌量更高（P<0.01）,感染后4天仅糖尿病感染组在脾脏检测出K.P。1.8肺组织HIF-1α水平:相比正常对照组,糖尿病非感染组HIF-1α水平均有降低趋势但未达到统计学差异。相比正常对照组和糖尿病非感染组,糖尿病和非糖尿病感染组HIF-1α水平均有明升高,但糖尿病感染组升高的程度明显低于非糖尿病感染组（P<0.01）。1.9相比正常对照组,非糖尿病感染组和糖尿病感染组BALF中巨噬细胞占比更高（P<0.01）且为BALF中主要细胞（超过70%）。2.HIF-1α在糖尿病小鼠合并肺炎克雷伯杆菌肺炎中的作用及可能机制2.1一般状态与生存率:相比糖尿病感染组,糖尿病DMOG感染组和糖尿病FG4592感染组一般状态改善,活动增加,眼角脓性分泌物减少,生存率改善显着（P<0.05）。2.2肺组织病理表现:相比糖尿病感染组,糖尿病DMOG感染组和糖尿病FG4592感染组肺组织充血水肿情况减轻、实变范围缩小、肺组织重量减轻（P<0.05）。2.3石蜡切片HE染色光镜下表现:相比糖尿病感染组,糖尿病DMOG感染组和糖尿病FG4592感染组肺组织HE染色炎症细胞浸润程度明显减轻（P<0.05）。2.4血清及肺泡灌洗液炎症因子检测:相比糖尿病感染组,糖尿病DMOG感染组和糖尿病FG4592感染组血清及BALF中多种炎症因子水平显着降低（P<0.05）。2.5肺和脾组织细匀浆计数:与糖尿病感染组相比,糖尿病DMOG感染组和糖尿病FG4592感染组细菌载量减少（P<0.05）。2.6肺组织HIF-1α水平:相比糖尿病感染组,糖尿病DMOG感染组和糖尿病FG4592感染组小鼠肺组织的HIF-1α被激活（P<0.01）。3.高糖低氧环境下上调HIF-1α对巨噬细胞功能的影响3.1高糖条件下,受到低氧刺激的RAW264.7细胞的HIF-1α未能被正常激活。且与RAW264.7细胞共培养的K.P存活数量比正常糖条件下明显升高（P<0.01）。3.2高糖条件下,应用DMOG及FG4592后,高糖抑制的RAW264.7细胞HIF-1α水平可以被激活,与RAW264.7细胞共培养的K.P存活数量明显减少（P<0.05）。3.3高糖条件下,RAW264.7细胞经LPS刺激后增殖能力被抑制,应用DMOG处理后增殖能力增加（P<0.01）。结论:1.糖尿病会加重小鼠肺炎克雷伯杆菌肺炎感染的程度。主要表现为生存率低、肺组织及脾组织细菌载量高、血清及BALF炎症因子水平高。且糖尿病小鼠合并肺炎克雷伯杆菌肺炎时,HIF-1α升高的表达被抑制。2.通过过表达HIF-1α可以减轻糖尿病合并肺炎克雷伯杆菌小鼠的感染病情,提高生存率、加快细菌清除、减轻炎症反应。3.高糖低氧条件下HIF-1α能通过提高RAW264.7细胞对肺炎克雷伯杆菌的清除能力及恢复LPS激活的增殖功能改善高糖时RAW264.7细胞对感染的应答。
高子剑[3]（2019）在《高G力学环境加载装置研制及其细胞力学状态研究》文中研究指明随着现代武器装备、科研设备的飞速发展,现代战斗机的机动性能越来越强大,载人航空航天活动也越来越频繁,飞行员和宇航员会有越来越多的机会处在高加速度环境中,持续的高加速度（高G）力学环境会对人体机能产生很大影响。而学界对这种影响的研究很少,且研究材料也很难获取。因此,研究人员退而求其次,选用小动物等作为研究材料,将其置于高G力学环境中一段时间后,通过实验分析来研究高G力学环境对其身体、组织、细胞的影响。本文详细调研了现有离心机种类及发展趋势,综述了国内外用于生物加载的离心机研究现状,通过总结分析,研制了可以为动物、细胞加载实验提供大小可控、稳定高G力学环境的加载设备。加载机主要由底座、传动机构、转子、伺服电机、控制箱、外机壳等部分组成。设计过程中,本文对底座部分使用有限元软件进行了模态分析,避免机器工作时,底座产生共振;对多种转子结构进行了讨论,最终选用结构稳定、便于加工的矩形型钢制作转子;通过计算选择了高性价比伺服电机,选择了方便编程和使用的文本显示器与PLC作为控制模块。主要性能参数包括:转子有效旋转半径为40cm,额定G值为40G,最大G值变化率6.7 G/s,可同时加载两只大鼠。加载机制作完成后,我们进行了动物加载预实验与分组实验,对加载机的加载效果进行了验证,并观察到大鼠经过不同高G力学环境加载后,身体、行动能力和生长发育都会产生变化,得出高G力学环境会对动物的行动能力和身体发育产生影响的结果。此外,本文设计制作的设备除了可以进行动物加载,也可以通过夹持装置为细胞提供一个高G力学环境。我们已经观察到高G加载后的成骨细胞会发生形状的变化,为了进一步研究高G环境下细胞的受力情况,我们建立了含有细胞骨架的细胞模型进行有限元分析。建模之前,本文首先对Abaqus有限元分析软件的量纲进行整理,整理出使用m、mm、μm作为长度单位的单位制,在软件中建模对各个单位制进行了验证,确定每个单位制中各个单位对应关系是正确的,可供研究人员日后建模时使用。然后,对单个细胞模型进行建模,综述了国内外现有学者建立的细胞有限元模型种类,并对其优缺点进行总结,在其基础上选择了含有细胞骨架的有限元模型。根据已有学者对细胞材料的研究,选取合适的尺寸参数、材料参数,建立细胞模型,对细胞添加不同大小的高G力,分析有无细胞骨架细胞模型受到高G力加载后,细胞形变情况,明确细胞骨架在抵抗细胞所受高G力、保持细胞形状中的作用,而且此模型可以预测高G力学环境加载实验中细胞的各种响应和变化。本文的工作主要是为实验室动物高G加载提供一种加载装置;进行了大鼠加载实验,分析高G力学环境对大鼠行动能力和生长发育的影响;建立了含有细胞骨架的细胞三维模型,为以后开展高G环境下细胞有限元模拟仿真工作打下了良好的基础。
黄国华[4]（2018）在《JNK调节支气管哮喘气道上皮细胞晚期糖基化终末产物受体RAGE表达的分子机制研究》文中研究说明背景及目的支气管哮喘是一种以慢性气道炎症为特征的异质性疾病,气道炎症是疾病的本质和核心环节,气道重塑是持续慢性炎症的直接后果。非过敏型哮喘表型患者无明确的过敏原、气道混合性炎症细胞、对于激素不敏感等特点,逐渐成为临床治疗难点,借助本实验室成熟的TDI小鼠模型研究呼吸道刺激物诱发的成年人哮喘意义深远。气道上皮细胞RAGE受体表达增多、β-catenin核聚集是TDI哮喘发病的重要发现,但机制不明。研究表明,JNK和RAGE在哮喘中扮演重要角色,但相互之间以及与β-catenin的作用在TDI哮喘发病中的机制尚未阐明。本研究意在探讨JNK、RAGE、β-catenin在TDI哮喘中的作用及机制。内容与方法一、哮喘患者、TDI哮喘动物模型、细胞系上测定RAGE受体、细胞核内β-catenin和JNK磷酸化水平。收集临床非哮喘、轻中重度哮喘患者气道上皮细胞,构建TDI诱导哮喘小鼠模型,体外用TDI-HSA处理16HBE细胞系。检测不同疾病、刺激后气道上皮细胞中RAGE受体、P-JNK蛋白和细胞核β-catenin分子的表达水平,分析它们之间的相关性。二、在TDI动物和细胞模型中干预JNK或RAGE成功构建TDI哮喘小鼠模型,激发前经腹腔给RAGE拮抗剂（FPS-ZM1）或JNK抑制剂（SP600125）,观察各项哮喘指标的变化,检测各组小鼠的气道反应性、气道周围炎症细胞、血清IgE、Th2炎症指标,同时检测气道上皮细胞中P-JNK、RAGE、和β-catenin表达和分布情况;用TDI-HSA或者JNK激动剂处理16HBE、RAGE-/-细胞,观察细胞中P-JNK、RAGE、和β-catenin表达和分布情况。三、构建RAGE启动子序列并验证与转录因子SP-1的直接结合利用庞大的生物信息学,预测能与RAGE启动子结合的转录因子,采用染色质免疫共沉淀技术证实SP-1能与RAGE启动子结合与否。结果一、通过对比哮喘与正常患者气道粘膜活检病理结果,发现在哮喘患者气道上皮细胞JNK明显活化,RAGE表达增多,并且与哮喘控制程度呈正相关;在成功构建的TDI诱导哮喘小鼠模型,通过肺组织免疫组化染色和蛋白定量Western Blot方法发现TDI哮喘小鼠较对照组小鼠在气道上皮细胞中P-JNK和RAGE受体高表达;用不同浓度的TDI-HAS刺激16HBE细胞,用Western免疫印迹（WB）的方法发现细胞JNK被磷酸化水平和RAGE受体蛋白水平增高。二、体内试验发现JNK抑制剂或RAGE抑制剂都可以缓解TDI诱导哮喘小鼠的气道炎症和减轻其气道高反应性,同时也能抑制细胞核β-catenin的聚集,调控β-catenin的细胞内重新分布;重要的是在TDI-HSA或者JNK激动剂刺激16HBE细胞中,JNK抑制剂通过调控RAGE受体表达抑制β-catenin细胞核聚集,而RAGE受体是否敲除对于JNK的磷酸化处理影响不大。提示JNK可以调控哮喘气道上皮细胞RAGE受体蛋白水平。三、通过体内实验证实TDI诱导哮喘小鼠肺组织RAGE受体蛋白mRAN水平上调,而且JNK抑制剂SP600125能抑制TDI诱导RAGE转录水平的升高,提示JNK可能通过某一个转录因子影响RAGE启动子活动;同时在体外实验,我们用JNK激动剂Anisomycin特异性激活JNK,用RT-PCR证明RAGE蛋白mRNA水平上调,证明JNK的磷酸化可以调控RAGE基因转录。为进一步研究RAGE蛋白在转录水平的上调机制,我们通过生物信息学相关网址搜素RAGE启动子的核苷酸序列,通过预测发现转录因子SP-1与RAGE启动子结合的可能性非常大,因此我们在活体细胞中,应用染色质免疫共沉淀技术CHIP成功证明转录因子SP-1可以与RAGE启动子直接结合;同时我们再次在16HBE细胞中用特异性JNK激动剂证明SP-1可以被P-JNK激活从而调节RAGE转录水平的。结论一、重症哮喘患者、TDI哮喘小鼠以及TDI-HSA处理后16HBE细胞系中JNK磷酸化水平、RAGE蛋白分子明显升高;二、JNK和RAGE参与了 TDI哮喘发病,并参与稳定β-catenin;三、JNK通过SP-1参与调控RAGE受体表达。
陈骋[5]（2018）在《龙胆苦苷对急性肺损伤及慢性肺纤维化的防治作用研究》文中进行了进一步梳理一、背景与目的急性肺损伤（acute lung injury,ALI）是由严重感染、创伤、中毒等多种病因导致肺组织产生广泛而过度的炎症反应[1-3],可进展成为急性呼吸窘迫综合征即ARDS（acute respiratory distress syndrome）而危及生命。其发病机制复杂,病死率高。炎性细胞及炎性介质的调控失调是导致ALI最重要的发病机制之一。对于ALI的药物治疗,尽管既往研究发现抗炎疗法具有降低肺损伤的潜在功效,但临床试验并没有取得令人信服的证据来证明糖皮质激素、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子、抗氧化剂等药物能显着降低ALI患者的病死率4[6]。因此,亟待研发更为有效的ALI治疗药物以服务患者。多项研究显示,microRNAs（miRNAs）参与ALI的发病调控[7,8],其具有调节炎症和免疫反应的潜能。因此,研究ALI药物治疗前后机体内miRNAs表达的变化情况,也成为找寻药物作用靶点的重要途径。ALI患者即便有幸渡过急性危险期,但幸存者仍可能出现长期后遗症,包括进展为慢性肺纤维化疾病而造成肺功能障碍,影响生活质量。肺纤维化（pulmonary fibrosis,PF）是由多种病因导致的慢性间质性肺疾病,患者5年生存率仅20%[9],其机制也尚未完全明确。目前治疗PF的新药主要是吡非尼酮（pirfenidone）和尼达尼布（Nintedanib）[10,11],但其价格昂贵,普通患者难以承受长期服药的费用支出。此外,我国至今仍无自主知识产权的抗PF药物。因此,研发具有我国自主知识产权的经济、高效、低毒的抗ALI及抗PF药物十分必要。龙胆苦苷（gentiopicroside,GPS）为苦胆草的主要有效成分,具有保肝、止痛、抗感染、抗脓毒血症相关性ALI等多种药理作用[12-15]。但GPS抗ALI的机制仍不明确,目前更缺乏GPS抗PF的研究报告。基于以上原因,本研究采用GPS干预模型小鼠ALI及PF的病变过程,从病理形态学、蛋白及基因表达水平等方面研究GPS对于ALI及PF的防治作用。此外,以miRNA表达谱芯片技术检测模型小鼠ALI病变前后miRNAs表达水平的变化,以期进一步明确GPS抗ALI的作用机制,并探索GPS是否具有抗PF的作用及其作用机制,为GPS防治ALI及慢性PF的研发提供实验依据。二、方法:1.分别建立脂多糖（Lipopolysaccharide,LPS）诱导的ALI小鼠模型及博来霉素（Bleomycin,BLM）诱导的慢性PF小鼠模型。2.肺组织常规HE染色、Masson染色、电子显微镜及NF-κB免疫组化染色等病理形态学检测,观察肺组织炎症、纤维化等病变及NF-κB蛋白表达情况。3.BCA（Bicinchoninic acid）法检测气管肺泡灌洗液（Bronchoalveolar Lavage Fluid,BALF）中总蛋白含量,ELISA（enzyme linked immunosorbent assay）测定BALF中TNF-α、IL-1β等细胞因子含量。BALF细胞涂片计数细胞数及分类细胞比例。4.采用试剂盒测定肺组织羟脯氨酸（Hydroxyproline,Hyp）、超氧化物歧化酶（Superoxide Dismutase,SOD）、髓过氧化物酶（Myeloperoxidase,MPO）及丙二醛（Malonaldehyde,MDA）的含量。5.Western blot 检测肺组织 AQP1、AQP5、TGF-β1、CTGF 等蛋白含量。6.qPCR检测AQP1及AQP5基因表达情况。7.miRNAs基因芯片检测GPS干预ALI病变前后肺组织miRNAs表达变化情况。8.体外实验,GPS干预经TGF-β1刺激的A549细胞,细胞免疫染色检测刺激前后细胞E-cathrin和α-SMA表达变化情况,以了解GPS对于A549细胞受TGF-β1 刺激发生上皮细胞-间质转化（Epithelial-mesenchymal transition,EMT）的影响。三、结果1.病理形态学检测显示LPS致ALI模型小鼠肺组织呈现弥漫性肺泡炎、肺组织严重水肿等病变,BLM致慢性PF模型小鼠肺组织表现为显着肺纤维化及炎症等病变。2.细胞涂片、ELISA、qPCR、Western Blot及免疫组化染色等检测显示,与生理盐水（normal saline,NS）组相比,ALI模型组小鼠BALF中蛋白总量、细胞总数、炎性细胞比例、TNF-α、IL-1β含量及肺组织中NF-κB蛋白表达均明显增加（P<0.05）,而肺组织中AQP1及AQP5基因、蛋白表达均明显降低（P<0.05）。与ALI模型组相比,GPS干预组BALF中蛋白总量、细胞总数、粒细胞比例、TNF-α、IL-1β含量及肺组织中NF-κB蛋白表达均明显降低（P<0.05）,而肺组织中AQP1及AQP5基因、蛋白表达均明显增加（P<0.05）,且高剂量组相应变化更明显、疗效与地塞米松组相当（P>0.05）。3.肺组织匀浆MPO、MDA及SOD检测显示,与NS组相比,ALI模型组小鼠肺组织中MDA、MPO含量明显升高而SOD含量显着下降（P<0.05）;与ALI模型组相比,GPS干预组其MDA、MPO含量明显降低而SOD含量明显升高(（P<0.05）,且高剂量组变化更为显着（P<0.05）。4.细胞涂片、Hpy含量、Western Blot及ELISA等检测显示,与NS组相比,同期PF模型组小鼠BALF中蛋白总量、巨噬细胞比例、TNF-α、IL-1β含量,肺组织中Hpy含量、TGF-β1及CTGF蛋白表达,均明显增加（P<0.05）。与PF模型组相比,同期GPS干预组肺组织及BALF中相应巨噬细胞比例、蛋白及细胞因子的含量均显着降低（P<0.05）且高剂量组下降更明显、疗效与DXM组相当（P>0.05）。5.免疫组化检测显示,与对照组相比,模型组A549经TGF-β1刺激后E-Cadherin阳性细胞率降低而α-SMA上升（P<0.05）。与模型组相比,GPS干预后E-Cadherin阳性细胞率明显增加而α-SMA显着降低,疗效与DXM组接近（P>0.05）,且呈现剂量相关性。6.miRNAs芯片检测共筛选出60个小鼠ALI致病相关性miRNAs,其主要参与显着的信号通路共36条,其中6条上调,30条下调;参与炎症及免疫反应调控的主要信号通路分别有6条及3条。7.Go-pathway分析显示,对于小鼠ALI的治疗,GPS及DXM均有药效的调控靶miRNAs共18个,且12个为上调,共调控885个预测的交集靶基因,参与了5条显着信号通路的调控。8.microRNA-Gene-Net分析显示,在LPS致小鼠ALI病变过程中,网络内度值最高的miRNAs为mmu-miR-124-3p和mmu-miR-6394,最高的基因则为Amot 和 B3gat2。四、结论:1.GPS能显着拮抗LPS致小鼠ALI病变。其作用机制为,通过降低BALF中蛋白渗出、细胞总数、粒细胞比例、TNF-α及IL-1β含量,下调肺组织中NF-κB蛋白,上调AQP1、AQP5基因及蛋白的表达,抑制肺组织中MDA及MPO活性,提高肺组织中SOD活性。2.在LPS致小鼠ALI病变过程中,起调控作用最强的两个miRNAs为mmu-miR-124-3p 和 mmu-miR-6394;Amot、B3gat2 等基因是被相对较多的miRNAs所调控的靶基因。3.对于LPS致小鼠ALI的治疗,GPS及DXM具有18个共同的药效调控靶miRNAs,且12个为上调。4.GPS能持续且显着的抑制BLM致慢性PF小鼠肺组织的炎症及纤维化病变。其作用机制为,通过减轻肺泡腔内分泌促纤维化因子的巨噬细胞渗出比例,降低BALF中TNF-α及IL-1β含量,下调肺组织中TGF-β1及CTGF蛋白的表达。5.GPS可抑制A549经TGF-β1诱导的EMT过程。肺泡上皮细胞及TGF-β1可能是GPS防治PF的关键性靶细胞及靶分子。
王全林[6]（2014）在《益气活血清金方抗博莱霉素致大鼠肺纤维化作用机制研究》文中提出目的：基于TGF-p/Smad信号通路初步探究益气活血清金方抗博莱霉素致大鼠纤维化生物学作用机制。方法：采用体重200±20g的SD雄性大鼠96只随机分为空白对照组（K）、模型组（BLM）、阳性对照组（P）、益气活血清金方中药组（Y）,每组24只,每笼8只。除K组外其余各组均采用一次性气管注射博来霉素（5mg/kg）法诱导肺纤维化模型,K组采用一次性气管注射生理盐水（5mg/kg）作为对照。K和BLM组每天生理盐水（10g/kgd）灌胃,P组用强的松（4.2mg/kg·d）灌胃,Y组用益气活血清金方（9.45g/kg·d）灌胃,于实验第7、14、28天分三批次处死动物,股动脉采血分离血清,用放射免疫法检测PCⅢNP、CⅣ、HA、LN;取肺组织做HE、Masson染色,免疫组化半定量法分析CⅠ、TGF-βRI、TGF-βRⅡ、Smad3、 Smad7含量,RT-PCR法分析TGF-β1mRNA、Smad3mRNA、Smad7mRNA表达量。结果：BLM组相关检测指标与K组相比均有统计学意义（P<0.05）。在促进体重增加、防止肺湿重过度增加、改善大鼠肺系数等方面Y组与BLM组相比可有显着性差异（P<0.05）。HE染色病理结果显示：在第28天时Y组与BLM组相比无明显纤维瘢痕形成。Masson染色结果显示：各时间点Y组代表胶原沉积的蓝染区明显比BLM组面积少,且颜色浅淡。放射免疫法检测PCⅢNP、CⅣ、HA、 LN的结果：中、后期Y组与BLM组相比均有统计意义（P<0.05）。免疫组化法检测CⅠ、TGF-βRI、TGF-βRⅡ、Smad3、Smad7平均积分光密度值（MIOD）结果：Y组与BLM组CⅠ、TpRⅠ、TβRⅡ、Smad3、Smad7的MIOD相比除TGF-βR Ⅰ第7、14天,Smad7第7天没有统计学差异,其它比较有统计学意义（P<0.05）。RT-PCR法检测TGF-β1、Smad3、Smad7mRNA结果：Y组与BLM组除Smad3、 Smad7mRNA第7天比较无明显统计学差异,其它均有统计学差异（P<0.05）。结论：益气活血清金方抗博莱霉素致大鼠肺纤维化的作用机制可能与其作用于TGF-β/Smad信号通路相关环节有关。
徐丽[7]（2012）在《天贝汤对支气管哮喘大鼠气道炎症和气道重塑的影响的实验研究》文中进行了进一步梳理目的：支气管哮喘（bronchial asthma，简称哮喘）是以气道炎症、气道重塑、可逆性气道阻塞、气道高反应性为主要特征的由多种因素引起的一种气道慢性炎症性疾病，是由嗜酸性粒细胞、肥大细胞和T淋巴细胞等多种炎症细胞参与的一种呼吸系统疾病。近二十年来，随着工业化和全球污染的加剧，在世界范围内哮喘的发病率和死亡率呈逐年上升的趋势，全球患者约3亿左右，严重威胁着人们的身体健康和生存质量。加之哮喘病程绵长难愈，给社会带来了严重的经济负担。所以，哮喘已成为严重的公共卫生问题而引起了世界各国的极大关注。到目前为止，全身或局部应用糖皮质激素仍然是治疗哮喘的首选，但长期应用副作用明显。中医中药防治哮喘应该受到重视，特别是在减少副作用，预防复发等方面与西药比较有一定的优势。本文还概述了历代中医学家对哮喘的病名、病因病机、辨证施治的认识，对中药及中医药治疗哮喘的现代临床与机理研究作了全面总结。阐述了哮喘的现代流行病学、病因病机等。天贝汤是导师郭振武教授的临床经验方，具有宣肺降气、化痰平喘之功。本课题在建立大鼠支气管哮喘模型的基础上，予天贝汤进行干预，通过对本动物实验的观察，选择与哮喘发病机制相关的多项指标，探讨天贝汤对支气管哮喘大鼠气道炎症和气道重塑的作用和机制，为中医中药临床治疗支气管哮喘提供理论依据。材料与方法：72只健康雄性SPF级Wistar大鼠，体重240±20g，实验动物许可证号SCXK（京）2009-0004，随机分为正常对照组、哮喘模型组、天贝汤高剂量组（以下简称为高剂量组）、天贝汤中剂量组（以下简称为中剂量组）、天贝汤低剂量组（以下简称为低剂量组）、小青龙对照组（以下简称为小青龙组），每组12只。天贝汤组成：麻黄、茯苓、清半夏、川贝、天麻等组成，小青龙胶囊组成：麻黄、白芍、细辛、干姜、炙甘草、桂枝、半夏、五味子。将上方加水煎煮三次合并后过滤。低温（4℃）放置备用。天贝汤高、中、低剂量组，给药剂量分别是：高剂量组9ml/kg,中剂量组4.5ml/kg，低剂量组2.25ml/kg，小青龙组给药剂量0.972g/kg。从第15天开始给药，直至处死，每日1次灌胃，连续6周。各组参照吕国平等介绍的方法，分为致敏和激发两步。除正常对照组外，实验第1d和第8d共2次每只大鼠腹腔注射新鲜配制的含10%卵蛋白的生理盐水1ml（内含卵蛋白100mg，氢氧化铝100mg和灭活百日咳杆菌6×109个）致敏，致敏15d后各组灌胃后1小时后将大鼠放入不完全封闭的雾化吸入箱内开始激发，用超声雾化器喷入含1%卵蛋白激发，每次雾化20分钟，每日1次，激发6周，激发后以大鼠烦躁、打喷嚏、咳嗽、抓鼻、大小便失禁、呼吸幅度加深及喘促发作、紫绀等哮喘发作症状，认为哮喘造模成功。正常对照组以生理盐水代替卵蛋白进行腹腔注射及雾化吸入，雾化流量及时间同前。第一部分天贝汤对支气管哮喘大鼠支气管病理组织学观察末次喷雾激发后18-24h内予乙醚麻醉动物，以固定板固定后打开并暴露胸腔，开胸结扎，剥离肺组织，取出肺组织，于4℃4%多聚甲醛固定，脱水、包埋、切片，HE染色观察。第二部分各组大鼠体重和被激发时的表现的变化第三部分天贝汤对支气管哮喘大鼠肺组织核因子-κB（NF-κB）的影响核因子-κB（NF-κB）是一种具有多种功能的核转录因子，具有广泛的生物学活性，不仅参与哮喘的气道炎症反应，还参与哮喘气道重塑的过程。动物分组、模型建立、用药情况及数据统计处理同前。动物麻醉完全后，取肺组织于4%多聚甲醛固定，脱水、包埋、切片，行免疫组织化学ABC法染色。一抗选用兔抗p52（N F-кB的一个亚单位）多克隆抗体（武汉博士德生物工程公司）稀释度1∶100;用SABC法试剂盒进行操作,操作步骤按试剂盒说明书进行。主要操作步骤如下：石蜡切片常规脱蜡脱水，3%H2O2溶液灭活内源性过氧化物酶，热修复1h。滴加山羊封闭血清，湿盒孵育，加入一抗（1:100稀释）湿盒孵育1h，4℃冰箱内过夜，PBS漂洗，加入生物素化二抗37℃孵育，PBS漂洗5min，3次。⑧滴加ABC复合物37℃孵育30min，PBS漂洗5min，3次。⑦二氨基联苯胺（DAB）光镜下显色5-15min，终止呈色反应。苏木精衬染，常规裱片、封片和观察。计算机图象处理软件半定量测定NF－κB表达。第四部分天贝汤对支气管哮喘大鼠血清中基质金属蛋白酶-9（MMP-9）、基质金属蛋白酶组织抑制剂-1（TIMP-1）的影响。气道重塑是慢性哮喘反复发作的重要病理生理基础，它与哮喘肺功能损害及气道高反应性密切相关。细胞外基质（ECM）的沉积和降解的失衡是导致气道壁结构异常、间质增生和肺实质破坏的重要原因，ECM主要由基质金属蛋白酶（MMPs）来降解,其中基质金属蛋白酶-9（MMP-9）是锌依赖性蛋白酶，MMP-9催化集团区含有3个重复的类Ⅱ型纤维连接蛋白结合区，决定了它对明胶和弹力纤维的底物特异性，主要降解Ⅳ型以及Ⅴ型胶原。近来研究表明MMP-9在支气管哮喘患者的气道炎症和气道重塑中发挥重要作用。动物分组、模型建立、给药情况及数据统计处理同第一部分。动脉血血清中MMP-9、TIMP-1含量检测：采用双抗体夹心法ABC-ELISA法测定MMP-9、TIMP-1含量，具体方法如下。①建立标准曲线：设标准孔8孔，每孔中加入样品稀释液100μl，第一孔加入标准品100μl，混匀后用加样器吸出100μl，移至第二孔，如此反复行对倍稀释至第七孔，最后，从第七孔中吸出100μl弃去，使之体积为100μl，第八孔为空白对照。②加样：待测样品孔中每孔加入待测样品100μl。③将反应板充分混匀后放置37℃120分钟。④洗板：用洗涤液将反应板充分洗涤4-6次，向滤纸上印干。⑤每孔中加入第一抗体工作液50μl，将反应板充分混匀后置37℃60分钟。⑥用洗涤液将反应板充分洗涤4-6次，向滤纸上印干。⑦每孔加酶标抗体工作液100μl，将反应板置37℃60分钟。⑧用洗涤液将反应板充分洗涤4-6次。每孔加入底物工作液100μl，置37℃暗处反应5-10分钟。每孔加入1滴终止液混匀，在492nm处测吸光值。以标准品2000、500、250、125、62、31、0ng/ml之OD值在半对数纸上作图，画出标准曲线，根据样品OD值在该标准曲线上查出MMP-9的含量，TIMP-1方法同MMP-9。第五部分天贝汤对支气管哮喘大鼠肺组织表面相关凋亡基因蛋白Fas和Bcl-2表达的影响动物分组、模型建立、用药情况及数据统计处理同前。动物完全麻醉后，取肺组织，加入Trizol充分匀浆，提取总RNA，采用RT-PCR法检测各组大鼠肺组织中相关凋亡基因蛋白Fas和Bcl-2表达的变化。统计学方法：数据采用均数±标准差（—x±s）表示，用SPSS统计软件处理，统计方法采用单因素方差分析及LSD检验。显着差异水平以0.05和0.01为标准。结果：1.天贝汤对哮喘大鼠支气管-肺组织病理学的影响肺组织肉眼形态观察:正常对照组:肺组织颜色淡红，肺组织柔软而富有弹性，表面光滑。哮喘模型组:肺组织过度膨胀，部分肺组织颜色变深，呈暗红色，质地稍硬，表面有呈颗粒状的瘀点。天贝汤各剂量组和小青龙组肺组织颜色稍暗，膨胀不明显，无瘀斑瘀点。光镜观察：正常对照组：大鼠支气管内及其周围无明显的炎性细胞浸润，支气管壁完整光滑，细胞排列规整，平滑肌层厚度正常，支气管粘膜规整，管腔内无脱落上皮细胞。模型组：支气管管壁及伴行的动脉周围有大量嗜酸性粒细胞、单核细胞及淋巴细胞为主的炎性细胞浸润，管腔内容物增多，微血管渗漏，可见管腔内炎性分泌物增多，有的小支气管甚至被粘液栓及炎性细胞所堵塞。杯状细胞增生，气道上皮指状增生，平滑肌层增厚，排列紊乱，支气管粘膜水肿增厚，上皮脱落，上皮下纤维化，支气管粘膜皱壁增多、延长。高剂量组：嗜酸性粒细胞及淋巴细胞等炎性细胞浸润明显减少，几乎消失，水肿明显消失，管壁和平滑肌层厚度接近正常对照组,逐渐恢复，支气管粘膜规整，支气管管腔内偶见脱落上皮细胞及粘液。中剂量组：嗜酸性粒细胞及淋巴细胞等炎性细胞浸润有所减少，管壁和平滑肌层厚度有所减少，气管管壁结构层次清楚，支气管管腔内偶见脱落上皮细胞及黏液，管腔渗出物逐渐吸收。低剂量组：支气管周围嗜酸性粒细胞及其他炎性细胞浸润略微减少，管壁和平滑肌层厚度略减少，管腔内偶见脱落上皮细胞及黏液。小青龙组：黏膜下层见轻度充血水肿及少量炎症细胞，管腔内见炎性渗出物，粘膜增生，支气管腔内少量脱落细胞和粘液。2.各组大鼠体重和被激发时的表现的变化体重：激发后各组大鼠体重均增。空白组大鼠体重与其余各组有差异，高于其余各组（p<0.01）；高、中、低剂量组，小青龙组及模型组之间无统计学意义（p>0.05）。被激发时的表现：空白组大鼠表现活泼好动，动作灵敏，毛色光滑，呼吸平稳。模型组大鼠在吸入OVA后不久即出现过敏症状如：躁动不安，搔抓、舔肢体、打喷嚏等，继而大鼠反应迟钝，出现呼吸急促，呼吸困难（明显的腹式呼吸），伴轻度紫绀，部分大鼠可闻及响亮的呼气相喘鸣音和不规则呼吸。与哮喘模型组比较，高、中剂量组症状减轻，无呼吸急促，无紫绀，无呼气相喘鸣音；低剂量组和小青龙组呼吸稍急促，无紫绀，喘鸣音减轻。在高中低剂量组比较中，高剂量组较低剂量组比较有明显好转，没有呼吸急促和呼吸困难症状，大鼠毛色光泽较好，精神也较好。3.对哮喘大鼠支气管NF－κB表达的影响与正常对照组比较，模型组NF－κB表达明显增加，差异具有显着性意义（P<0.01）。与模型组比较，NF－κB在各治疗组阳性表达减少，高剂量组降低最明显（P<0.01），其次为中剂量组、小青龙组、小剂量组；与小青龙组对比，高剂量组NF－κB含量低，二者差异具有显着意义﹙p<0.01﹚。4.对支气管哮喘大鼠动脉血清中基质金属蛋白酶-9（MMP-9）、组织基质金属蛋白酶抑制剂-1（TIMP-1）的影响。与正常对照组相比，模型组大鼠MMP-9、TIMP-1含量明显升高，差异具有显着性意义﹙p<0.01﹚，证明哮喘模型建立成功；与模型组比较，各治疗组MMP-9含量均降低，高剂量组降低最明显﹙p<0.01﹚，其次为中剂量组、小青龙组，低剂量组次之。与小青龙组相比，高剂量组含量低，二者差异具有显着意义﹙p<0.01﹚。5.对支气管哮喘大鼠相关基因蛋白Fas mRNA、Bcl-2mRNA表达的影响。与正常对照组比较，模型组Bcl-2mRNA表达明显增多（P﹤0.01），Fas mRNA表达明显减少﹙p<0.05﹚；与模型组比较，各治疗组Bcl-2mRNA表达减少，高剂量组减少最明显﹙p<0.01﹚，其次为中剂量组、小青龙组、小剂量组，与小青龙组比较高、中、低剂量组无统计学意义；与低剂量组比较，高剂量组Bcl-2mRNA表达强度低，二者差异具有显着意义﹙p<0.05﹚。与模型组比较，Fas mRNA在各治疗组表达有所增多,高剂量组增多最明显﹙p<0.05﹚，其次为中剂量组、小青龙组、小剂量组，但均无统计学意义；与小青龙组比较高、中、低剂量组均无统计学意义。与低剂量组比较，高、中剂量组、小青龙组均无统计学意义。结论：1.哮喘发病与痰、风等致病因素有关。风盛痰阻、气道挛急是哮喘发作的主要病机，治疗以宣肺降气、化痰平喘及调理脏腑并举。2.天贝汤具有宣肺降气、化痰平喘及调理脏腑的作用，对哮喘有确切的治疗作用。3天贝汤治疗哮喘的作用机制3.1对气道重塑的影响。对支气管-肺组织病理学观察结果显示，模型组支气管粘膜上皮部分脱落，黏膜下层充血水肿，嗜酸性粒细胞等炎细胞浸润，黏膜下平滑肌显着增生肥厚。与正常对照组相比，模型组出现气道重塑。经天贝汤治疗后，气管管壁结构逐渐恢复，炎症明显减轻，水肿明显消失，增生的平滑肌细胞基本恢复正常。提示天贝汤具有抑制哮喘豚鼠气道重塑，从而发挥平喘作用。其机制可能是通过减少气道EOS浸润，减少炎症介质分泌、释放，减轻炎性细胞渗出，抑制杯状细胞和平滑肌细胞增生，从而减轻气道炎症反应，抑制气道重塑。3.2天贝汤能降低支气管哮喘大鼠肺组织中NF－κB的含量，从而从细胞因子角度解释天贝汤对气道炎症的抑制作用。3.3天贝汤抑制气道重塑和细胞外基质沉积的作用可能与其降低动脉血清中MMP-9、TIMP-1含量有关。3.4天贝汤抑制气道炎症和气道重塑的作用可能与其降低肺组织中Bcl-2mRNA表达，增加Fas mRNA表达有关。4.天贝汤对实验性哮喘大鼠的平喘作用，具有剂量依赖关系，并且部分优于经典方剂小青龙汤，其机制有待于进一步深入研究。天贝汤通过多途径、多层次、多靶点抑制气道炎症和气道重塑，具有广阔的应用前景。
何晓燕[8]（2010）在《let-7a靶向调控NIRF基因对肺癌A549细胞增殖的影响及分子机制研究》文中研究说明目的借助生物信息学手段对let-7a的靶基因进行预测和分析,以期获得更多的有关let-7a参与的转录后调控机制的信息。方法利用miRGen数据库,以hsa-let-7a基因为检索词,选择miRanda,PicTar及TargetScanS三种计算机方法预测结果的交集,对let-7a靶基因进行预测,并通过该数据库提供的GO（Gene Ontology）注释信息对靶基因的生物学功能进行分析,筛选保守程度高、结合自由能低并且与肿瘤细胞增殖密切相关的基因作为候选靶基因。结果经生物信息学预测,我们得到了82个let-7a靶向作用的蛋白编码基因,并筛选出8个与肿瘤增殖相关的基因作为候选靶基因,包括:NRAS、CDC34、TUSC2、NIRF、GAS7、DUSP1、RB1及PDGFB。基于NIRF（Np95/ICBP90-like RING finger）在肿瘤细胞增殖活动中的重要作用,我们着重对候选靶基因NIRF进行了分析。NIRF基因定位于9p23-24.1,全长共802个氨基酸残基,含有NIRFN、PHD、SRA及RING四个结构域;NIRF 3′UTR（untranslation region）含有一个let-7a的结合位点,其与let-7a 5′端的第1-9位碱基序列完全互补,let-7a与NIRF靶基因二聚体结构的自由能为-16.89kcal/mol,而且该NIRF 3′UTR结合位点在四个物种（包括人、小鼠、大鼠、犬）的基因组中高度保守。结论let-7a涉及的调控范围非常广泛,NIRF很可能是let-7a的一个靶基因。目的通过实验方法验证NIRF基因是否是let-7a的直接作用靶基因。方法构建含有NIRF 3′UTR全长的荧光素酶报告质粒pRL-TK- NIRF 3′UTR;将pRL-TK或pRL-TK-NIRF 3′UTR与pGL3-control,及let-7a mimics或control mimics共转染A549细胞（let-7a表达很低）,双荧光素酶报告系统检测转染后A549细胞中荧光素酶的表达;将pRL-TK或pRL-TK- NIRF 3′UTR与pGL3-control,及let-7a inhibitor或control inhibitor共转染HeLa细胞（表达内源性的let-7a）,双荧光素酶报告系统检测转染后HeLa细胞中荧光素酶的表达;分别以let-7a mimics或control mimics转染A549细胞,let-7a inhibitor或control inhibitor转染HeLa细胞,Western blot检测NIRF蛋白表达的变化。结果经测序证实荧光素酶报告质粒pRL-TK-NIRF 3′UTR构建成功;共转染let-7a mimics,pRL-TK-NIRF 3′UTR与pGL3-control的A549细胞组,荧光素酶活性明显降低（P<0.01）,为对照组（共转染pRL-TK与pGL3-control的A549细胞组）的49.29%;共转染let-7a inhibitor,pRL-TK-NIRF 3′UTR与pGL3-control的HeLa细胞组,荧光素酶活性显着增强（P<0.01）,比对照组（共转染pRL-TK与pGL3-control的HeLa细胞组）增加了46.77%;Western blot检测显示,与未转染的A549细胞相比,转染let-7a mimics的A549细胞中NIRF蛋白的表达显着降低（P<0.01）,而转染control mimics的A549细胞中NIRF表达无明显变化（P>0.05）;与未转染的HeLa细胞相比,转染let-7a inhibitor的HeLa细胞中NIRF蛋白的表达显着增加（P<0.01）,而转染control inhibitor的HeLa细胞中NIRF表达无明显变化（P>0.05）。结论NIRF 3′UTR含有let-7a的调控信息,let-7a负性调控NIRF基因的表达,NIRF是let-7a的一个靶基因。目的研究let-7a对A549细胞增殖的影响并探索其分子机制。方法构建let-7a真核表达质粒pGenesil-let-7a,同时设计并构建一个阴性对照质粒pGenesil-control;构建针对NIRF基因的特异性siRNA表达质粒si-1、si-2、si-3及对照质粒si-nc;将pGenesil-let-7a及pGenesil-control转染肺癌A549细胞,G418筛选,并经Real-time RT-PCR检测let-7a的表达进行验证,从而建立稳定表达pGenesil-let-7a及pGenesil-control的A549细胞株,分别命名为A549-let-7a及A549-control细胞;采用MTT法比较A549、A549-control及A549-let-7a细胞的增殖能力并绘制生长曲线;流式细胞术分析各组细胞的细胞周期;Western blot及免疫细胞荧光检测各组细胞中NIRF、p21WAF1及p27kip1蛋白的表达水平;NIRF基因的siRNA表达质粒si-1、si-2、si-3及si-nc分别转染A549细胞,Western blot检测NIRF及p21WAF1蛋白表达的变化;pIRES2-EGFP-NIRF及pIRES2-EGFP质粒分别转染A549-let-7a细胞,Western blot检测NIRF及p21WAF1蛋白的表达水平。结果经测序证实,重组质粒pGenesil-let-7a及pGenesil-control构建成功,NIRF基因的siRNA表达质粒si-1、si-2、si-3及si-nc构建成功;Real-time RT-PCR结果证实,与A549细胞相比,A549-let-7a细胞中let-7a的表达水平显着增加（P<0.01）,为A549细胞中表达量的5.34倍,而A549-control中let-7a的表达无明显变化（P>0.05）,表明成功获得稳定表达细胞株,即A549-let-7a及A549-control细胞;MTT结果显示A549-let-7a细胞较A549细胞增殖能力明显降低;流式细胞分析结果表明A549-let-7a细胞生长停滞于G1期;Western blot显示,与A549细胞相比,A549-let-7a细胞中NIRF的表达明显减少（P<0.01）,p21WAF1蛋白的表达明显增加（P<0.01）,p27kip1蛋白的表达无明显变化（P>0.05）;免疫细胞荧光亦发现,与A549细胞相比,A549-let-7a细胞中NIRF的表达明显减少（P<0.01）,p21WAF1蛋白的表达明显增加（P<0.01）;Western blot分析A549细胞中NIRF基因的RNAi效果显示,si-1、si-2及si-3均能显着地抑制NIRF基因的表达（P<0.01）,其抑制率分别为70.27%,42.85%及65.49%,而各组相应的p21WAF1蛋白表达显着增加（P<0.01）,与未处理的A549细胞相比,分别增加了64.21%,25.73%及34.54%;Western blot结果表明,与未处理的A549-let-7a细胞相比,转染pIRES2-EGFP-NIRF的A549-let-7a细胞中NIRF表达显着增加（P<0.01）,p21WAF1表达显着降低（P<0.01）。结论let-7a对A549细胞的生长的抑制作用至少部分是通过靶向调控NIRF,上调p21WAF1蛋白的表达水平实现的。目的研究let-7a对A549细胞裸鼠移植瘤生长的影响及其可能的分子机制。方法将A549、A549-control及A549-let-7a细胞分别接种至裸鼠背部皮下,观察移植瘤的生长情况并计算抑瘤率,30天后处死裸鼠,取出瘤体并称重;Real-time RT-PCR检测各组肿块中let-7a的表达水平;HE染色观察瘤组织的形态学改变;Western blot及免疫组织化学检测各组肿块中NIRF及p21WAF1蛋白的表达差异。结果与A549细胞注射组相比,A549-let-7a细胞注射组裸鼠的瘤组织质量显着降低（P<0.01）,抑瘤率为27.51%,A549-control细胞注射组无显着差异（P>0.05）;Real-time RT-PCR结果显示A549-let-7a细胞注射组瘤组织中let-7a的表达水平较A549细胞注射组显着增加（P<0.01）,为A549细胞注射组的4.25倍,而A549-control细胞注射组let-7a的表达水平无明显变化（P>0.05）;HE染色显示A549-let-7a细胞注射组,癌细胞较其它两组体积减小,核浆比例明显缩小,核分裂相显着减少;Western blot及免疫组织化学结果均表明,与A549细胞注射组相比,A549-let-7a细胞注射组瘤组织标本中NIRF的表达明显减少（P<0.01）,p21WAF1蛋白的表达明显增加（P<0.01）;而A549及A549-control细胞注射组中NIRF和p21WAF1蛋白的表达无显着性差异（P>0.05）。结论let-7a能显着抑制A549细胞在体内的生长能力,其机制可能与let-7a靶向调控NIRF引起的p21WAF1蛋白表达的上调有关。
高建[9]（2009）在《当归补血总苷的研制及对实验性肺纤维化的干预作用和分子机制研究》文中研究说明特发性肺纤维化（Idiopathic pulmonary fibrosis ,IPF）是一种原因不明、以弥漫性肺泡炎和肺泡结构紊乱最终导致肺间质纤维化为特征的疾病。主要临床表现是逐渐加重的呼吸困难,伴有刺激性干咳,病情一般持续进展,最终因呼吸衰竭而病死,其发病率和死亡率很高,预后极差。IPF的发病机制尚未明了,然而目前肺纤维化治疗尚无特效药物,IPF已成为临床治疗的难点。研究肺纤维化发病机理和寻找行之有效的治疗药物是目前医学界迫切需要解决的课题。中医经典名方当归补血汤由当归、黄芪组成,两者均有抗肺纤维化作用。前期研究表明,对于博莱霉素诱导的大鼠肺纤维化模型,当归补血总苷能明显减轻肺泡炎症和纤维化程度。本课题拟观察肺纤维化形成过程中胶原基质重塑在IPF发病机制中的动态变化,探索IPF防治新的作用靶点。同时在整体水平上研究当归补血总苷对IPF胶原基质重塑的调控作用从而探讨其对IPF的防治作用及机制,研究当归补血总苷对实验性肺纤维化形成过程中TGF-β1等细胞因子的影响,以及对MMPs和TIMPs局部表达失衡的调节作用,和其对TGF-β1/Smads信号转导通路的影响,为中医药益气活血协同抗肺纤维化提供现代科学依据。目的制备当归补血总苷并建立其质量控制标准,优选当归补血汤中有效部位的提取工艺,建立当归补血总苷HPLC指纹图谱,并以此考察当归补血总苷的质量。观察当归补血总苷对实验性肺纤维化大鼠肺系数及肺组织病理形态的影响以及血清中HA,LN,PCⅢ、CⅣ,TGF-β1,COLⅠ和IL-13水平的变化;探讨肺纤维化大鼠肺组织中MMP-1、MMP-9与TIMP-1 mRNA的改变,并观察当归补血总苷对肺纤维化大鼠肺组织、MMP-1、MMP-9与TIMP-1表达的影响;探讨PF模型中体内成纤维细胞表型转分化和TGF-β1-Smad3途径在肺纤维化发生发展中的作用,阐明当归补血总苷对肺成纤维细胞表型转分化及TGF-β/Smads信号转导通路的影响及其机制。方法采用薄层色谱法对当归补血总苷中的黄芪甲苷和阿魏酸进行定性鉴别;采用紫外分光光度法测定当归补血总苷的含量;采用HPLC法测定当归补血总苷中的黄芪甲苷、黄芪苷Ⅱ和阿魏酸的含量。设计L9（34）正交试验,采用HPLC法测定黄芪甲苷、阿魏酸的含量作为质控指标,考察乙醇浓度（A）、乙醇用量（B）、提取时间（C）和提取次数（D）4个因素对当归补血总苷提取的影响,优化提取工艺。采用HPLC-DAD,Diamonsil C18色谱柱（250 mm×4.6 mm, 5μm）,乙腈―水二元梯度洗脱,流速1.0 mL·min-1,（λ=203 nm）,柱温为30℃,建立了当归补血总苷的HPLC指纹图谱。180只Wistar大鼠随机分为正常对照组、模型对照组、强的松组和当归补血总苷大、中、小剂量组,每组30只。除正常对照组外,其他五组均采用经气管滴注博莱霉素A5建立大鼠肺纤维化模型,造模后第二日起当归补血总苷大、中、小剂量组每天用当归补血总苷（剂量64、32、16 mg·kg-1）灌胃,强的松组用醋酸强的松混悬液（剂量3 mg·kg-1）灌胃,每日一次,每组分别于7、14和28天随机处死10只大鼠采集肺组织,观察各组光镜、电镜（当归补血总苷组中剂量组）下的病理学变化以及比较各组肺系数,以及血清中HA,LN,PCⅢ、CⅣ,TGF-β1,COLⅠ和IL-13水平的变化。RT-PCR法检测当归补血总苷对肺纤维化大鼠肺组织MMP-1、MMP-9与TIMP-1 mRNA表达的影响;Western blotting和RT-PCR法分别检测大鼠正常组、模型组、当归补血总苷组不同组别中a-SMA、TGF-β、COLⅠ、Smad3、P-Smad3等蛋白及mRNA的表达。结果黄芪甲苷在0.85～6.76μg之间呈良好的线性关系（r=0.9992）,平均回收率为97.53%,RSD为0.82%。黄芪苷Ⅱ在1.05～8.4μg之间呈良好的线性关系（r=0.9994）,平均回收率为94.82%,RSD为2.16%。阿魏酸在0.07～0.53μg之间呈良好的线性关系（r=0.9998）,平均回收率为99.74%,RSD为1.62%。最佳提取条件为采用8倍量70%乙醇提取2次,每次2h。建立的当归补血总苷的HPLC指纹图谱确定了12个共有峰,各峰相对保留时间的RSD在0.21.0%之间,相对峰面积的RSD在1.6 3.2%之间。结果发现,不同批次当归补血总苷质量基本稳定,通过HPLC指纹图谱能够较好地控制其质量。与模型对照组相比,TGDGBX （16-64 mg·kg-1）及强的松组肺系数明显降低（P<0.01）,肺组织病理观察显示肺泡炎及肺纤维化程度均明显减轻;TGDGBX （16-64 mg·kg-1）能显着降低BLM诱导的PF大鼠血清中升高的的HA,LN,PCⅢ和CⅣ水平,显着降低PF大鼠血清中IL-13含量,且造模后7、14和28 d三个时间点均有效。TGDGBX （16-64 mg·kg-1）可抑制BLM诱导的肺纤维化大鼠肺组织在肺纤维化不同阶段MMP-1 mRNA、MMP-9 mRNA的表达,提高TIMP-1mRNA的表达,使MMPs/TIMPs表达趋于平衡。进一步研究发现,TGDGBX （16-64 mg·kg-1）可以显着降低PF大鼠血清中升高的TGF-β1和COLⅠ水平。TGDGBX （16-64 mg·kg-1）可明显抑制肺纤维化不同阶段肺组织α-SMA和TGF-β1的表达,抑制肺组织升高的α-SMA、TGF-β1、COLⅠmRNA和蛋白的表达水平;下调肺纤维化不同阶段肺组织升高的Smad 3、P-Smad 3蛋白和Smad3 mRNA水平。结论该提取工艺稳定性和重现性良好,简便,快速,可行;本方法制备的TGDGBX质量可控,检测方法精密度、重现性良好,准确,适用于TGDGBX的质量控制。TGDGBX能减轻肺泡炎性水肿、保持肺泡结构及阻抑纤维化形成,能够明显减少博莱霉素诱导肺纤维化大鼠ECM的生成,提示其对肺纤维化有一定防治作用。TGDGBX抗PF可能与其降低血清中升高的TGF-β1水平、促进COLⅠ胶原降解作用有关。提示TGDGBX可能通过对调节MMP1、MMP9/TIMP1表达实现对ECM重塑的调控;TGDGBX可通过TGF-β1环节下调Smad3和P-Smad 3表达,降低COLⅠ表达,从而减少ECM胶原沉积,发挥抗PF作用。但TGF-β1/Smads的改变与MMPs/TIMPs水平的相关性等尚需进一步研究。
牛忠英,张建中,汤楚华,施生根,张铭[10]（2008）在《高+Gx环境对猴口腔黏膜上皮c-fos表达的影响》文中提出目的:观察模拟空间环境航天应急返回过程中高+Gx对猴口腔黏膜上皮细胞c-fos表达的影响。方法:以9只雄性猕猴为对象,随机分为4组,对照组承受+1Gx、300s的超重作用;实验组根据承受过载峰值的大小分为3个亚组,分别承受过载峰值为+15Gx、200s;+18Gx、165s;+21Gx、140s的超重作用。采用常规组织病理学方法,观察猴口腔黏膜上皮细胞的改变;采用免疫组织化学PicTureTM两步法,观察高+Gx对猴口腔黏膜上皮c-fos表达的影响。结果:组织病理学观察显示,对照组和实验组动物口腔黏膜上皮均未见明显病理学改变。免疫组化学观察显示,实验组口腔黏膜上皮基底细胞和棘细胞呈深棕色,为c-fos强阳性表达,对照组口腔黏膜上皮部分基底细胞和少量棘细胞呈浅棕色,为c-fos弱阳性表达。高+Gx实验组之间口腔黏膜上皮c-fos表达无明显差异。结论:高+Gx可引起猴口腔黏膜上皮细胞c-fos表达增强。
二、持续高+G_x对猴肺组织病理学影响的初步观察（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、持续高+G_x对猴肺组织病理学影响的初步观察（论文提纲范文）
（1）mRNA/piRNA/piwi在DEN诱导肝癌中的表达及紫草素对肝癌细胞生物学行为的影响（论文提纲范文）
| 中英文缩略词对照表 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 第一部分 DEN诱导大鼠肝癌模型的建立及mRNA芯片分析 |
| 1 研究内容与方法 |
| 1.1 研究对象 |
| 1.2 研究内容与方法 |
| 1.3 统计学方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第二部分 piRNA/piwi与肝癌的关系研究 |
| 1 研究内容与方法 |
| 1.1 实验对象 |
| 1.2 研究内容与方法 |
| 1.3 统计学方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第三部分 紫草素对肝癌细胞CBRH-7919 的影响 |
| 1 研究内容与方法 |
| 1.1 实验对象 |
| 1.2 研究内容与方法 |
| 1.3 统计学方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 结论 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 综述 piRNA/piwi 在癌症中的作用 |
| 参考文献 |
| 攻读博士学位期间获得的学术成果 |
| 个人简历 |
| 导师评阅表 |
（2）低氧诱导因子-1α在糖尿病小鼠肺炎克雷伯杆菌肺炎中的作用及机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略语 |
| 第一部分:探究糖尿病合并肺炎克雷伯杆菌肺炎的感染特点以及HIF-1α的表达情况 |
| 1 前言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 主要试剂和仪器 |
| 2.1.1 主要试剂 |
| 2.1.2 主要仪器 |
| 2.2 实验动物及分组 |
| 2.3 细菌培养 |
| 2.3.1 肺炎克雷伯杆菌培养基配制 |
| 2.3.2 菌株冻存液 |
| 2.3.3 细菌的保种和复苏 |
| 2.3.4 细菌接种物的制备 |
| 2.3.5 实验用细菌悬液的制备 |
| 2.4 C57bl/6 小鼠实验模型的建立 |
| 2.4.1 糖尿病造模所需溶液的配制 |
| 2.4.2 C57bl/6 小鼠糖尿病模型的建立 |
| 2.4.3 C57bl/6 小鼠血糖测量 |
| 2.4.4 C57bl/6 小鼠肺炎克雷伯杆菌肺炎模型的建立 |
| 2.5 实验方法 |
| 2.5.1 小鼠一般状态及生存率观察 |
| 2.5.2 小鼠血清的取材 |
| 2.5.3 小鼠肺和脾组织的无菌取材及肺组织称重 |
| 2.5.4 小鼠肺和脾组织的细菌载量测定 |
| 2.5.5 小鼠肺组织病理取材 |
| 2.5.6 小鼠肺组织病理学切片制作 |
| 2.5.7 小鼠肺组织病理切片HE染色及炎症细胞浸润程度评分 |
| 2.5.8 小鼠肺泡灌洗液取材 |
| 2.5.9 小鼠肺泡灌洗液及血清PCT、IL-6 等炎症因子水平测定 |
| 2.5.10 提取小鼠肺组织蛋白 |
| 2.5.11 BCA法测肺组织样品蛋白浓度 |
| 2.5.12 制备用于Western Blot的样品 |
| 2.5.13 Western Blot检测HIF-1α在肺组织中水平 |
| 2.5.14 小鼠肺组织HIF-1α切片免疫组化 |
| 2.5.15 流式细胞术 |
| 2.5.16 统计方法 |
| 3 结果 |
| 3.1 小鼠一般状态和生存率 |
| 3.2 小鼠肺组织病理表现 |
| 3.3 小鼠肺组织石蜡切片HE染色光镜下表现 |
| 3.4 小鼠肺泡灌洗液炎症因子TNF-α和 IL-6 |
| 3.5 小鼠血清炎症因子TNF-α和 IL-6 |
| 3.6 小鼠血清PCT |
| 3.6.1 感染24 小时 |
| 3.6.2 感染2天 |
| 3.7 小鼠肺组织及脾组织细菌载量 |
| 3.7.1 肺组织 |
| 3.7.2 脾组织 |
| 3.8 小鼠肺组织HIF-1α表达水平 |
| 3.9 小鼠感染肺炎克雷伯杆菌肺炎24h后肺泡灌洗液巨嗜细胞比例 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 第二部分:探究糖尿病合并肺炎克雷伯杆菌肺炎的感染特点以及HIF-1α的表达情况 |
| 1 前言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 主要试剂和仪器 |
| 2.1.1 主要试剂 |
| 2.1.2 主要仪器 |
| 2.2 实验动物及分组 |
| 2.3 细菌培养 |
| 2.3.1 培养基配制 |
| 2.3.2 菌株冻存液 |
| 2.3.3 细菌的保种和复苏 |
| 2.3.4 细菌接种物的制备 |
| 2.3.5 实验用细菌悬液的制备 |
| 2.4 C57bl/6 小鼠实验模型的建立 |
| 2.4.1 糖尿病造模所需溶液的配制 |
| 2.4.2 C57bl/6 小鼠糖尿病模型的建立 |
| 2.4.3 C57bl/6 小鼠血糖测量 |
| 2.4.4 C57bl/6 小鼠肺炎克雷伯杆菌肺炎模型的建立 |
| 2.4.5 HIF-1α过表达模型的建立 |
| 2.5 实验方法 |
| 2.5.1 小鼠一般状态及生存率观察 |
| 2.5.2 小鼠血清的取材 |
| 2.5.3 小鼠肺和脾组织的无菌取材 |
| 2.5.4 小鼠肺和脾组织的培养和细菌载量测定 |
| 2.5.5 小鼠肺组织病理取材 |
| 2.5.6 小鼠肺组织病理学切片制作 |
| 2.5.7 小鼠肺组织病理切片HE染色及炎症细胞浸润程度评分 |
| 2.5.8 小鼠肺泡灌洗液取材 |
| 2.5.9 小鼠肺泡灌洗液及血清PCT水平测定 |
| 2.5.10 提取小鼠肺组织蛋白 |
| 2.5.11 BCA法测肺组织样品蛋白浓度 |
| 2.5.12 制备用于Western Blot的样品 |
| 2.5.13 Western Blot检测HIF-1α在肺组织中水平 |
| 2.5.14 小鼠肺组织HIF-1α切片免疫组化 |
| 2.5.15 小鼠肺泡灌洗液及血清IL-6、MCP-1 等炎症因子水平测定 |
| 2.5.16 统计方法 |
| 3 结果 |
| 3.1 小鼠一般状态和生存率 |
| 3.2 小鼠肺组织病理表现 |
| 3.3 小鼠肺组织石蜡切片HE染色光镜下表现 |
| 3.4 小鼠肺泡灌洗液炎症因子 |
| 3.5 小鼠血清炎症因子 |
| 3.6 小鼠血清PCT |
| 3.6.1 感染24 小时 |
| 3.6.2 感染2天 |
| 3.7 小鼠肺组织及脾组织菌落匀浆计数 |
| 3.7.1 肺组织 |
| 3.7.2 脾组织 |
| 3.8 小鼠肺组织HIF-1α表达水平 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 第三部分:HIF-1α在糖尿病小鼠合并肺炎克雷伯杆菌肺炎中的作用及可能机制探讨 |
| 1 前言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 主要试剂和仪器 |
| 2.1.1 主要试剂 |
| 2.1.2 主要仪器 |
| 2.2 实验对象 |
| 2.3 实验溶液配制 |
| 2.3.1 细胞培养基 |
| 2.3.2 过表达HIF-1α的溶液 |
| 2.4 细菌细胞培养 |
| 2.4.1 培养基配制 |
| 2.4.2 菌株冻存液 |
| 2.4.3 细菌的保种和复苏 |
| 2.4.4 细菌接种物的制备 |
| 2.4.5 实验用细菌悬液的制备 |
| 2.4.6 细胞复苏 |
| 2.4.7 过表达细胞HIF-1α细胞处理 |
| 2.5 实验方法 |
| 2.5.1 RAW264.7 清除肺炎克雷伯杆菌能力的测定 |
| 2.5.2 提取RAW264.7 细胞蛋白 |
| 2.5.3 BCA法测肺组织样品蛋白浓度 |
| 2.5.4 制备用于Western Blot的样品 |
| 2.5.5 巨噬细胞增殖能力的测定 |
| 2.5.6 统计分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 RAW264.7 体外吞噬清除肺炎克雷伯杆菌能力 |
| 3.2 DMOG和 FG4592 作用后RAW264.7 细胞的HIF-1α表达情况 |
| 3.3 上调HIF-1α浓度对高糖条件下RAW264.7 细胞增殖功能的影响。 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 本研究创新性的自我评价 |
| 参考文献 |
| 综述 低氧诱导因子-1α(HIF-1α)在糖尿病并发症中的作用 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间取得的研究成果 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（3）高G力学环境加载装置研制及其细胞力学状态研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 研究背景 |
| 1.2 高G加载装置的发展与现状 |
| 1.2.1 高G力学环境介绍 |
| 1.2.2 高G加载装置的产生 |
| 1.2.3 载人离心机的发展 |
| 1.2.4 实验室用离心机 |
| 1.2.5 高G加载装置所存在的问题 |
| 1.3 细胞仿真模型建立意义 |
| 1.4 本文研究内容和创新点 |
| 1.4.1 研究内容 |
| 1.4.2 创新点 |
| 第二章 动物高G加载机的设计分析与制作 |
| 2.1 动物高G加载机的方案设计 |
| 2.1.1 确定加载机技术指标 |
| 2.1.2 确定加载机的技术路线 |
| 2.2 动物高G加载机结构设计 |
| 2.2.1 加载机整体结构 |
| 2.2.2 鼠笼的设计 |
| 2.2.3 转臂（转子）设计分析 |
| 2.2.4 底座及主轴设计 |
| 2.2.5 加载机护罩设计 |
| 2.3 加载机底座模态分析 |
| 2.3.1 模态分析的意义 |
| 2.3.2 建立有限元模型 |
| 2.3.3 有限元分析结果 |
| 2.4 动物高G加载机控制部分设计 |
| 2.4.1 电机的选择 |
| 2.4.2 控制器PLC的选择 |
| 2.4.3 文本显示器的选择 |
| 2.4.4 文本显示器编程 |
| 2.4.5 PLC编程 |
| 2.5 动物高G加载机的制作 |
| 2.5.1 加载机制作材料的选择 |
| 2.5.2 加载机的硬件连接 |
| 2.6 本章小结 |
| 第三章 动物高G加载基础实验 |
| 3.1 加载实验的预实验 |
| 3.1.1 加载机的空载实验 |
| 3.1.2 大鼠加载预实验 |
| 3.2 高G加载对大鼠行动能力影响实验 |
| 3.2.1 实验材料 |
| 3.2.2 实验分组 |
| 3.2.3 加载参数确定 |
| 3.2.4 加载实验结果 |
| 3.3 高G加载对大鼠体重影响实验 |
| 3.3.1 实验材料 |
| 3.3.2 加载方案 |
| 3.3.3 加载实验结果 |
| 3.4 实验结果讨论 |
| 3.5 本章小结 |
| 第四章 单个细胞在高G力学环境下的有限元仿真分析 |
| 4.1 细胞仿真模型种类 |
| 4.1.1 细胞连续体模型 |
| 4.1.2 细胞骨架网络模型 |
| 4.1.3 细胞连续体模型与细胞骨架模型结合 |
| 4.2 细胞模型的选择 |
| 4.3 细胞建模单位的确定 |
| 4.3.1 微米单位制的计算 |
| 4.3.2 在Abaqus软件中对所计算的单位进行验证 |
| 4.4 建立单个细胞有限元模型 |
| 4.5 高G力学环境加载下细胞仿真结果 |
| 4.6 本章小结 |
| 第五章 全文总结与展望 |
| 5.1 全文总结 |
| 5.2 展望 |
| 参考文献 |
| 发表论文和科研情况说明 |
| 致谢 |
（4）JNK调节支气管哮喘气道上皮细胞晚期糖基化终末产物受体RAGE表达的分子机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 第一章 JNK和RAGE在哮喘气道上皮细胞表达上调并呈正相关性 |
| 1.1 背景 |
| 1.2 材料与方法 |
| 1.3 结果 |
| 1.4 讨论 |
| 第二章 JNK信号通路通过调节RAGE表达参与调控哮喘气道炎症 |
| 2.1 背景 |
| 2.2 材料与方法 |
| 2.3 结果 |
| 2.4 讨论 |
| 第三章 JNK通过其下游转录因子SP1参与调节RAGE表达 |
| 3.1 背景 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.3 结果 |
| 3.4 讨论 |
| 全文小结 |
| 参考文献 |
| 攻读博士学位期间主要成果 |
| 致谢 |
（5）龙胆苦苷对急性肺损伤及慢性肺纤维化的防治作用研究（论文提纲范文）
| 缩略词表(以字母顺序排列) |
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 第一部分 龙胆苦苷对LPS致急性肺损伤的防治作用研究 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 第二部分 龙胆苦苷对LPS致急性肺损伤小鼠miRNA表达影响的初步研究 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 第三部分 龙胆苦苷对慢性肺纤维化的防治作用研究 |
| 前言 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 全文小结 |
| 研究的创新和特色 |
| 综述一 肺纤维化形成中的关键靶细胞及分子研究进展 |
| 参考文献 |
| 综述二 龙胆苦苷的药理作用研究进展 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间获得的学术成果 |
| 致谢 |
（6）益气活血清金方抗博莱霉素致大鼠肺纤维化作用机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 英文缩略词 |
| 目录 |
| 引言 |
| 第一部分 PF相关病证的益气活血清金法理论探讨 |
| 1.1 基于“益气活血清金法”的“肺痹”理论探讨 |
| 1.2 基于“益气活血清金法”的“肺痿”理论探讨 |
| 1.3 基于致PF的DIPLD相关疾病的益气活血清金法理论探讨 |
| 第二部分 实验研究 |
| 2.1 实验研究背景 |
| 2.1.1 TGF-β1是致肺纤维化的重要细胞因子 |
| 2.1.2 TGF-β/Smad信号通路是致肺纤维化的重要信号通路 |
| 2.1.3 肺纤维化程度的评价指标 |
| 2.2 实验方案图 |
| 2.3 实验材料 |
| 2.3.1 实验动物 |
| 2.3.2 实验药品 |
| 2.3.3 实验试剂 |
| 2.3.4 实验仪器及设备 |
| 2.4 实验方法 |
| 2.4.1 实验动物分组 |
| 2.4.2 实验动物造模 |
| 2.4.3 给药方法 |
| 2.4.4 实验动物处理与标本采集 |
| 2.4.5 实验检测项目及方法 |
| 2.5 统计分析 |
| 2.6 实验结果 |
| 2.6.1 一般情况观察 |
| 2.6.2 肺组织湿重变化情况 |
| 2.6.3 肺系数变化情况 |
| 2.6.4 肺组织病理学结果 |
| 2.6.5 放射免疫法检测PCⅢNP、C Ⅳ、HA、LN结果 |
| 2.6.6.2 C IV结果 |
| 2.6.7 免疫组化法检测C Ⅰ、TGF-β R Ⅰ、Ⅱ、Smad3、Smad7 |
| 2.6.8 RT-PCR法检测TGF-β1、Smad3、Smad7mRNA结果 |
| 2.7 讨论 |
| 2.7.1 动物模型的选择及评判 |
| 2.7.2 阳性对照组药物的选择 |
| 2.7.3 益气活血清金方组成及方义 |
| 2.7.4 病理学结果讨论 |
| 2.7.5 作用机制讨论 |
| 2.7.6 综合讨论 |
| 第三部分 结论 |
| 第四部分 问题及展望 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附图Ⅰ |
| 附图Ⅱ |
| 附图Ⅲ |
| 附图Ⅳ |
| 附图Ⅴ |
| 附图Ⅵ |
| 附图Ⅶ |
| 附综述一 肺纤维化发病机制研究概况 |
| 参考文献 |
| 附综述二 中医学对肺纤维化的认识概况 |
| 参考文献 |
| 在读期间公开发表的学术论文、专着及科研成果 |
（7）天贝汤对支气管哮喘大鼠气道炎症和气道重塑的影响的实验研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 文献综述 |
| 一、现代医学对哮喘的认识 |
| 二、祖国医学对哮喘的认识 |
| 实验一 天贝汤对支气管哮喘大鼠肺组织核因子-κB（NF-κB）的影响 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 结果 |
| 分析讨论 |
| 结论 |
| 实验二 天贝汤对支气管哮喘大鼠动脉血清中基质金属蛋白酶9和组织基质金属蛋白酶抑制物1含量的影响 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 结果 |
| 分析讨论 |
| 结论 |
| 实验三 天贝汤对支气管哮喘大鼠肺组织表面 Fas 和 Bcl-2 mRNA 表达的影响 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 结果 |
| 分析讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（8）let-7a靶向调控NIRF基因对肺癌A549细胞增殖的影响及分子机制研究（论文提纲范文）
| 英汉缩略语名词对照 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 论文正文：let-7a 靶向调控NIRF 基因对肺癌A549 细胞增殖的影响及分子机制研究 |
| 前言 |
| 第一部分 人类let-7a 靶基因的生物信息学预测及分析 |
| 1 研究方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第二部分 let-7a 靶向调控NIRF 基因的表达研究 |
| 第一节 荧光素酶报告质粒pRL-TK-NIRF 3′UTR 的构建和鉴定 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 第二节let-7a 靶向调控NIRF 基因的表达 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 参考文献 |
| 第三部分 let-7a靶向调控 NIRF对肺癌 A549 细胞增殖的影响及分子机制的研究 |
| 第一节 let-7a 真核表达载体的构建和鉴定及其对肺癌 A549 细胞增殖的影响 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 第二节 let-7a 靶向调控NIRF 基因抑制肺癌A549 细胞增殖能力的分子机制研究 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 参考文献 |
| 第四部分 let-7a 对肺癌A549 细胞裸鼠移植瘤生长的抑制作用 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 参考文献 |
| 彩图 |
| 全文总结 |
| 文献综述 |
| 致谢 |
| 攻读博士学位期间发表的论文及承担科研项目情况 |
（9）当归补血总苷的研制及对实验性肺纤维化的干预作用和分子机制研究（论文提纲范文）
| 英文缩略词 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 论文正文 当归补血总苷的研制及对实验性肺纤维化的干预作用和分子机制研究 |
| 第一部分 当归补血总苷的制备及其质量标准研究 |
| 前言 |
| 实验材料 |
| 实验方法与结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 第二部分 当归补血总苷对实验性肺纤维化大鼠的干预作用研究 |
| 前言 |
| 实验材料 |
| 实验方法 |
| 检测内容 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 第三部分 当归补血总苷对实验性肺纤维化干预作用的分子机制研究 |
| 前言 |
| 实验材料 |
| 实验方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 文献综述 |
| 参考文献 |
四、持续高+G_x对猴肺组织病理学影响的初步观察（论文参考文献）
- [1]mRNA/piRNA/piwi在DEN诱导肝癌中的表达及紫草素对肝癌细胞生物学行为的影响[D]. 王延蛟. 新疆医科大学, 2021(08)
- [2]低氧诱导因子-1α在糖尿病小鼠肺炎克雷伯杆菌肺炎中的作用及机制研究[D]. 张涵茵. 中国医科大学, 2021(02)
- [3]高G力学环境加载装置研制及其细胞力学状态研究[D]. 高子剑. 天津理工大学, 2019(08)
- [4]JNK调节支气管哮喘气道上皮细胞晚期糖基化终末产物受体RAGE表达的分子机制研究[D]. 黄国华. 南方医科大学, 2018(01)
- [5]龙胆苦苷对急性肺损伤及慢性肺纤维化的防治作用研究[D]. 陈骋. 昆明医科大学, 2018(01)
- [6]益气活血清金方抗博莱霉素致大鼠肺纤维化作用机制研究[D]. 王全林. 成都中医药大学, 2014(06)
- [7]天贝汤对支气管哮喘大鼠气道炎症和气道重塑的影响的实验研究[D]. 徐丽. 辽宁中医药大学, 2012(06)
- [8]let-7a靶向调控NIRF基因对肺癌A549细胞增殖的影响及分子机制研究[D]. 何晓燕. 重庆医科大学, 2010(04)
- [9]当归补血总苷的研制及对实验性肺纤维化的干预作用和分子机制研究[D]. 高建. 安徽医科大学, 2009(11)
- [10]高+Gx环境对猴口腔黏膜上皮c-fos表达的影响[J]. 牛忠英,张建中,汤楚华,施生根,张铭. 实用口腔医学杂志, 2008(03)