猪副流感病毒5型全基因组序列分析及反向遗传操作系统建立

论文摘要

猪副流感病毒（porcine parainfluenza-5 virus,PPIV5）系不分节段的单股负链RNA病毒,为副粘病毒科,腮腺炎病毒属成员之一。在1956年该病毒首次在猴体内被发现和被分离,并被命名为猴病毒5型（SV5）,在1995年国际病毒学分类委员会上该病毒被正式命名为（simian parainfluenzavirus 5）。后该病毒在其他动物体内及细胞培养物中均被检测到,意味着猴并不是该病毒的唯一宿主,于是在2009年病毒学分类委员会上该病毒被首次命名为（parainfluenza virus 5,PIV5）。2018年国际病毒学委员会上将该病毒重新命名为（mammalian rubulavirus 5）,本文中将使用PIV5表示副流感病毒。在本实验室前期工作当中,将该病毒做仔猪动物回归实验（详细数据另行发表,未在本文中体现）,结果表明该病毒虽然可感染猪肠道但不会导致腹泻及体温升高,尽本人所知无文献报道该病毒会导致猪只严重疾病。故本研究目的为建立PPIV5的反向遗传操作系统,为作为递送外源蛋白的载体奠定基础。将分离到的PPIV5病毒命名为CHNJS-17株,根据Gen Bank上所公布的序列,我们设计了6对引物,覆盖了除3’和5’端的病毒的基因组,通过RT-PCR方法扩增其相应序列,并对这6个序列进行T载体连接及转化至感受态细胞,提取质粒后测序。同时,利用RACE技术测定了PPIV5的3’和5’端具体序列。我们测得的序列分析结果显示,本实验室分离到的毒株全长15 246 bp,符合副粘病毒的“六碱基原则”。纤突蛋白F及HN与经典毒株W3A株比较氨基酸差异较小,分别为98.3%和97.3%,小疏水蛋白（SH）差异最大,为91.1%。将CHNJS-17株与NCBI所公布的28株PIV5全基因组序列进行比对,进化树分析显示与登录号为KX100034株、KY685075株、MH370862株、MG921602株、MH362816株同在一个进化分支,同源性分析显示与MG921602株、MH362816株、MH370862株、KX100034株、KC237064株最高,为99.8%,与KY114804株同源性最低,为97%。由此可知PIV5的进化树划分及同源性与宿主种属之间无相关性。表达T7聚合酶的重组痘病毒（MAV-T7）可提供T7聚合酶并被应用于拯救负链RNA病毒（negative-strand RNA viruses,NSV）,为了成功拯救PPIV5,本实验选用其作为转录病毒基因组之用。本研究使用的载体为p OK12载体,该载体为低拷贝载体,可容纳较大基因组。在全基因组的3’端加入T7启动子和稳定T7启动子的三个脱氧核苷酸G,及锤头状核酶（hammerhead ribozyme,Ham Rz）,在5’端加入丁戊肝核酶（hepatitis deltavirus ribozyme,Hdv Rz）和T7终止子。PIV5符合副粘病毒中的“六碱基原则”,故加入的Ham Rz和Hdv Rz可保证病毒基因组的精确切割,提高病毒拯救成功率。由于本病毒为负链RNA病毒,故在病毒转录中必不可少的辅助蛋白为核衣壳蛋白NP、磷酸化蛋白P、大聚合酶蛋白L,在本研究中以pc DNA3.1（-）为载体分别构建表达NP、P、L的三个辅助质粒,与病毒基因组全长质粒按4:2:2:1的比例共转染提前感染了MAV-T7的仓鼠肾细胞（BHK21）,方可拯救病毒。为区别拯救毒株与野生毒株,在病毒基因组中加入了亲本毒株中不存在的分子标签,通过鉴定能够区分野毒株的与拯救毒的分子标签4768G-（T）,鉴定结果为突变成功,将拯救的PPIV5命名为r PIV5-4768G（T）,通过电镜观察拯救的r PIV5-4768G（T）符合副粘病毒的外形特征,大小不一,具有多形性,视野内可观察到由病毒破裂而流出的“拉锁型”病毒基因,病毒外膜布满密集的纤突,间接免疫荧光（IFA）结果显示病毒拯救成功,一步生长曲线显示拯救毒与亲本毒在第12小时存在差异。以无致病性的PPIV5为亲本毒的r PIV5-4768G（T）反向遗传系统的建立可以作为很好的载体,为外源病毒蛋白的表达尤其是猪源肠道病毒如猪流行性腹泻病毒（PEDV）S蛋白的表达奠定基础。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 英文缩略词表
• 第一章 文献综述
•   1.1 PPIV5 分类
•   1.2 PPIV5 结构
•   1.3 PPIV5 蛋白功能
•   1.4 PPIV5 基因组结构
•   1.5 副粘病毒感染细胞的方式
•   1.6 副粘病毒反向遗传操作系统研究进展
•   1.7 负链RNA病毒作为载体疫苗进展
• 第二章 PPIV5 全基因组测序及序列分析
•   2.1 材料
•     2.1.1 细胞与毒株来源
•     2.1.2 主要试剂
•     2.1.3 主要仪器
•     2.1.4 参考毒株
•   2.2 方法
•     2.2.1 PPIV5 全基因组分段扩增引物设计与合成
•     2.2.2 5'/3'RACE套式引物的设计与合成
•     2.2.3 病毒繁殖、鉴定及RNA的提取
•     2.2.4 病毒c DNA的合成
•     2.2.5 病毒全基因组分段RT-PCR的建立
•     2.2.6 病毒全基因组分段胶回收
•     2.2.7 感受态细胞的制备
•     2.2.8 病毒全基因组的连接及转化
•     2.2.9 摇菌、重组质粒的鉴定、提取及测序
•     2.2.10 病毒RNA的 Poly（A）修饰及纯化
•     2.2.11 病毒5'、3'RACE反应的建立
•     2.2.12 PPIV5-F、HN基因的扩增
•   2.3 结果
•     2.3.1 病毒在Vero上的增殖结果
•     2.3.2 PPIV5的PCR鉴定结果
•     2.3.3 PPIV5 的电镜检测结果
•     2.3.4 病毒基因组分段扩增结果
•     2.3.5 5'、3'RACE反应建立的结果
•     2.3.6 PPIV5 病毒的测序及拼接结果
•     2.3.7 PPIV5-F、HN基因扩增结果
•     2.3.8 PPIV5 病毒全基因核苷酸序列进化树分析结果
•     2.3.9 PPIV5 全基因苷酸序列同源性分析结果
•     2.3.10 PPIV5 F基因进化树分析结果
•     2.3.11 PPIV5 HN进化树基因分析结果
•     2.3.12 PPIV5 F基因同源性分析结果
•     2.3.13 PPIV5 HN基因同源性分析结果
•   2.4 讨论
• 第三章 PPIV5 反向遗传全长的质粒构建及辅助质粒的构建
•   3.1 材料
•     3.1.1 病毒、细胞、感受态细胞及载体
•     3.1.2 主要试剂
•     3.1.3 主要实验仪器
•   3.2 方法
•     3.2.1 PPIV5 CHNJS-17 株全基因组感染性克隆的构建
•     3.2.2 全基因组载体选择
•     3.2.3 元件序列合成
•     3.2.4 引物设计
•     3.2.5 反应体系
•     3.2.6 PPIV5-C片段的克隆
•     3.2.7 CHNJS-17 株辅助质粒N/P/L的构建引物设计
•   3.3 结果
•     3.3.1 A和 D段扩增结果
•     3.3.2 元件扩增结果
•     3.3.3 ABCD段扩增结果
•     3.3.4 PPIV5-ABD拼接结果
•     3.3.5 全基因组拼接结果
•     3.3.6 辅助质粒构建结果
•   3.4 讨论
• 第四章 PPIV5 及表达EGFP的重组PPIV5 的拯救及鉴定
•   4.1 材料
•     4.1.1 细胞及质粒
•     4.1.2 主要试剂
•   4.2 材料
•     4.2.1 病毒拯救
•     4.2.2 电镜检测
•     4.2.3 间接免疫荧光及一步生长曲线检测
•     4.2.4 表达EGFP的重组PPIV5 的构建策略
•   4.3 结果
•     4.3.1 拯救的病毒粒子P1 代电镜
•     4.3.2 拯救的病毒粒子P10 代电镜
•     4.3.3 拯救的病毒粒子P10 代间接免疫荧光结果
•     4.3.4 拯救的病毒粒子分子标签的检测
•     4.3.5 拯救的病毒第10 代一步生长曲线测定
•     4.3.6 表达EGFP的重组PPIV5 的鉴定
•   4.4 讨论
• 第五章 结论
• 参考文献
• 致谢
• 个人简历
• 附录

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 丛广义

导师: 冯力

关键词: 猪副流感病毒型,全基因组序列分析,反向遗传

来源: 黑龙江八一农垦大学

年度: 2019

分类: 基础科学,农业科技

专业: 生物学,畜牧与动物医学

单位: 黑龙江八一农垦大学

分类号: S852.651

总页数: 96

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