CRISPR-Cas9系统介导的工业酵母营养缺陷型菌株构建

论文摘要

以组氨酸营养缺陷型菌株构建为例,在前期分离、诱变和筛选得到的安琪酵母工业菌株衍生菌株K-a中试用CRISPR-Cas9系统进行基因修饰。针对菌株K-a为单倍体、ura3和对潮霉素B敏感的特点,构建了以URA3为选择标记的Cas9表达载体YCplac33-Cas9、以hph NT1为选择标记的gRNA表达载体pRS42H-gHIS1,使用PCR方法合成donor DNA片段。使用醋酸锂法制备感受态细胞K-a （YCplac33-Cas9）、将pRS42H-gHIS1和donor DNA共转化,涂布(CMG-URA+300μg/ml潮霉素B)平板,经表型筛选和PCR产物测序证明筛选平板生长菌落为目的转化子K-a （his1）的比例为74. 4%,初步建立了适于利用CRISPR/Cas 9系统进行基因修饰的工业菌株宿主平台和相应的简便、快速进行基因修饰的操作技术流程。

论文目录

• 1 材料与方法
•   1.1 材料
•     1.1.1 菌株、质粒和引物
•     1.1.2 培养基和生长条件
•     1.1.3 主要试剂和仪器
•   1.2 质粒构建
•   1.3 donor DNA合成
•   1.4 酿酒酵母感受态细胞的制备及转化
•   1.5 生长评价
• 2 结果
•   2.1 Cas 9蛋白表达菌株K-a（YCplac33-Cas 9）的构建2.1.1质粒YCplac33-Cas9的构建
•   2.1.2菌株K-a（YCplac33-Cas9）的构建
•   2.2 宿主菌株K-a潮霉素B抗性水平测试
•   2.3 HIS1营养缺陷型菌株构建
•     2.3.1 g RNA表达质粒pRS42H-gHIS1构建
•     2.3.2 donor DNA片段的PCR合成
•     2.3.3 K-a（his1）菌株构建
•   2.4 缺陷型菌株和亲本菌株的生长评价
• 3 讨论

文章来源

类型: 期刊论文

作者: 陆海燕,李佳蔓,孙思凡,章小毛,丁娟娟,邹少兰

关键词: 酿酒酵母,基因敲除

来源: 中国生物工程杂志 2019年10期

年度: 2019

分类: 基础科学

专业: 生物学

单位: 天津大学化工学院系统生物工程教育部重点实验室

基金: 天津市科技计划项目(18YFZCNC01240),国家自然科学基金(31470208)资助项目

分类号: Q78

DOI: 10.13523/j.cb.20191008

页码: 67-74

总页数: 8

文件大小: 238K

下载量: 238