绿脓杆菌flgE基因DNA疫苗的研究

论文摘要

绿脓杆菌是一种广泛存在于空气、水、土壤中的条件致病菌。它能引起动物败血症、菌血症、化脓性肺炎等多种疾病,也会造成人的烧伤感染和脓胸。近年来,由于动物饲养规模的不断扩大,绿脓杆菌原发病发病率明显升高,会造成幼小动物的绿脓杆菌病大幅度爆发。当前对于绿脓杆菌病的治疗主要依赖高剂量、长周期的使用抗生素等化学药品,已发现绿脓杆菌具有广谱耐药性,能够选择的有效抗菌药物较少,增加了临床治疗的难度。因此,研制高效、实用的疫苗,进行方便、安全有效的预防接种将成为防治绿脓杆菌病最有效、最经济的方法。flgE可能是绿脓杆菌鞭毛中除构成鞭毛体的组成蛋白FliC蛋白外还未被认识的毒力因子,有着很强的免疫刺激性,可诱使机体产生强烈的免疫应答。本实验以flgE基因为研究对象,通过PCR技术扩增目的基因,克隆于真核表达载体pcDNA3.1（+）中构建出重组质粒pflgE。将BALB/c小鼠分为7组,分别为DNA疫苗组、DNA疫苗菊粉灌胃组、DNA疫苗菊粉做佐剂组、油乳剂灭活疫苗、油乳剂鞭毛蛋白疫苗、pcDNA3.1（+）空载体组和PBS阴性对照组。每两周免疫一次,共免疫三次。称取小鼠的摄食量和体重,计算食物转化率,用间接ELISA法检测血清抗体水平,MTT法检测淋巴细胞增殖情况,试剂盒法检测IFN-γ分泌水平,对小鼠进行攻毒,计算各组小鼠存活数和保护率。对最佳免疫效果的DNA疫苗,以不同的剂量对小鼠进行免疫,检测免疫鼠血清抗体水平,同时进行淋巴细胞增殖试验检测疫苗诱导的细胞免疫应答水平,并且计算每组的保护率,确定最佳免疫剂量。试验结果表明,DNA疫苗具有免疫作用,但免疫效果不如灭活疫苗和鞭毛蛋白疫苗。DNA疫苗中DNA疫苗菊粉做佐剂组免疫效果最好,最佳免疫剂量为20%。本文研究的关于flgE基因的DNA疫苗可以为绿脓杆菌疫苗的后续研究奠定一定的基础。

论文目录

• 摘要
• abstract
• 第1章 文献综述
•   1.1 绿脓杆菌病概述
•     1.1.1 形态培养特征
•     1.1.2 流行病学
•     1.1.3 耐药性
•     1.1.4 耐药机理
•     1.1.5 诊断方法
•     1.1.6 防治方法
•   1.2 绿脓杆菌疫苗研究进展
•     1.2.1 脂多糖、多糖和多糖结合疫苗
•     1.2.2 Ⅳ型菌毛疫苗
•     1.2.3 外膜蛋白疫苗
•     1.2.4 灭活疫苗
•     1.2.5 减毒活疫苗
•     1.2.6 鞭毛蛋白疫苗
•     1.2.7 DNA疫苗
•   1.3 DNA疫苗概述
•     1.3.1 DNA疫苗作用机制
•     1.3.2 DNA疫苗优缺点
•     1.3.3 DNA疫苗现状
•   1.4 DNA疫苗载体研究进展
•   1.5 真核表达载体pcDNA3.1（+）简介
•   1.6 研究内容与方法
• 第2章 重组质粒 pcDNA3.1（+）的构建
•   2.1 试验材料
•     2.1.1 试验菌株
•     2.1.2 主要试剂
•     2.1.3 主要仪器
•     2.1.4 试剂的配置
•     2.1.5 培养基的配置
•   2.2 试验方法
•     2.2.1 绿脓杆菌基因组的提取
•     2.2.2 目的基因flgE的扩增
•     2.2.3 flgE基因PCR产物胶回收
•     2.2.4 真核表达载体pcDNA3.1（+）的提取
•     2.2.5 flgE基因和pcDNA3.1（+）的双酶切
•     2.2.6 目的基因flgE和真核表达载体pcDNA（3.1+）的连接
•     2.2.7 大肠杆菌DH5α感受态的制备
•     2.2.8 重组质粒的转化
•     2.2.9 重组子的验证
•   2.3 结果与分析
•     2.3.1 绿脓杆菌基因组提取结果
•     2.3.2 目的基因flgE的PCR扩增结果
•     2.3.3 真核表达载体pcDNA3.1（+）的提取结果
•     2.3.4 重组子验证结果
•   2.4 讨论
• 第3章 绿脓杆菌FlgE基因DNA疫苗的免疫效果
•   3.1 试验材料
•     3.1.1 试验菌株及动物
•     3.1.2 主要试剂
•     3.1.3 主要仪器
•     3.1.4 培养基的配置
•     3.1.5 试剂的配置
•   3.2 试验方法
•     3.2.1 pcDNA3.1（+）/flgE重组质粒的大量提取
•     3.2.2 绿脓杆菌鞭毛蛋白的提取
•     3.2.3 绿脓杆菌鞭毛蛋白的SDS-PAGE的电泳检测
•     3.2.4 灭活疫苗和鞭毛蛋白疫苗的制备
•     3.2.5 动物饲养及免疫
•     3.2.6 采血及血清分离
•     3.2.7 免疫抗体检测
•     3.2.8 脾淋巴细胞增殖试验
•     3.2.9 IFN-γ分泌水平检测
•     3.2.10 攻毒保护试验
•   3.3 结果与分析
•     3.3.1 绿脓杆菌鞭毛蛋白的提取结果
•     3.3.2 灭活疫苗和鞭毛蛋白疫苗的制备
•     3.3.3 各组小鼠食物转化率
•     3.3.4 血清抗体检测结果
•     3.3.5 MTT检测结果
•     3.3.6 IFN-γ分泌水平
•     3.3.7 攻毒试验结果
•   3.4 讨论
• 第4章 DNA疫苗菊粉最佳添加量的确定
•   4.1 试验材料
•     4.1.1 试验动物和菌株
•     4.1.2 主要试剂
•     4.1.3 主要仪器
•     4.1.4 培养基的配制
•     4.1.5 试剂的配制
•   4.2 动物饲养及免疫
•     4.2.1 动物饲养及免疫
•     4.2.2 血清抗体检测
•     4.2.3 脾淋巴细胞增殖试验
•     4.2.4 IFN-γ分泌水平检测
•     4.2.5 攻毒保护率检测
•   4.3 结果与分析
•     4.3.1 血清抗体检测结果
•     4.3.2 MTT检测结果
•     4.3.3 IFN-γ分泌水平
•     4.3.4 攻毒试验结果
•   4.4 讨论
• 第5章 结论
• 参考文献
• 致谢
• 攻读硕士学位期间的研究成果

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 郭洁真

导师: 宫强

关键词: 绿脓杆菌,免疫,疫苗

来源: 河南科技大学

年度: 2019

分类: 基础科学,农业科技

专业: 生物学,畜牧与动物医学

单位: 河南科技大学

分类号: S852.61

总页数: 67

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