重组腺病毒载体Ad-EGFP-Klotho构建的实验研究

重组腺病毒载体Ad-EGFP-Klotho构建的实验研究

论文摘要

目的本研究旨在构建并制备增强型荧光蛋白(EGFP)基因和Klotho基因重组腺病毒载体AdEGFP-Klotho,并将其感染HEK293细胞,为基因治疗提供研究基础。方法设计含有NheⅠ与NotⅠ双酶切位点的引物,应用PCR方法扩增Klotho基因,将其连接到EGFP标记的pDC316-mCMV穿梭质粒上,构建重组穿梭质粒pDC316-mCMV-EGFP-Klotho,利用Polyfectin脂质体将骨架质粒和重组穿梭质粒共转染HEK293细胞进行同源重组,得到重组腺病毒Ad-EGFP-Klotho,并包装扩增,测定病毒颗粒数及滴度。采用PCR方法对重组腺病毒载体Ad-EGFP-Klotho进行鉴定,并进行Klotho基因测序。结果经PCR和NheⅠ、NotⅠ双酶切鉴定,重组腺病毒载体Ad-EGFP-Klotho中证实含有Klotho基因,测序结果和设计序列比对一致,重组腺病毒载体Ad-EGFP-Klotho构建成功。滴度为2.0×1010 Tu/mL,成功感染HEK293细胞,感染复数(MOI)=100,感染效率达91.75%,从Ad-EGFP-Klotho重组腺病毒载体中可以检测到3 045bp的条带,表明目的基因已成功整合在重组腺病毒载体Ad-EGFP-Klotho基因组中。结论应用细胞内同源重组方法成功构建了含有EGFP和Klotho基因的重组腺病毒载体Ad-EGFP-Klotho,制备获得高滴度的病毒,可高效感染HEK293细胞并表达目的蛋白。

论文目录

  • 1 材料与方法
  •   1.1 材料
  •     1.1.1 质粒、菌株与细胞
  •     1.1.2 实验试剂
  •   1.2 方法
  •     1.2.1 引物设计
  •     1.2.2 重组穿梭质粒pDC316-mCMV-EGFP-Klotho的构建及鉴定
  •     1.2.3 重组腺病毒载体Ad-EGFP-Klotho的包装
  •     1.2.4 重组腺病毒质粒Ad-EGFP-Klotho的扩增及纯化
  •     1.2.5 重组腺病毒Ad-EGFP-Klotho转染HEK293细胞情况
  •     1.2.6 重组腺病毒Ad-EGFP-Klotho的病毒滴度测定
  • 2 结果
  •   2.1 重组穿梭质粒pDC316-mCMV-EGFP-Klotho的鉴定
  •   2.2 重组腺病毒Ad-EGFP-Klotho的鉴定
  •   2.3 重组腺病毒Ad-EGFP-Klotho感染HEK293细胞的效率
  •   2.4 重组腺病毒Ad-EGFP-Klotho的滴度测定
  • 3 讨论
  • 文章来源

    类型: 期刊论文

    作者: 贾政,刘茜,邢正江,邹弘麟,李亚雄,魏玲,韦杰,李春城,孟凡棣

    关键词: 基因,绿色荧光蛋白质类,腺病毒,杂合子

    来源: 重庆医学 2019年23期

    年度: 2019

    分类: 医药卫生科技,基础科学

    专业: 生物学,基础医学

    单位: 昆明医科大学附属延安医院心脏大血管外科/云南省心血管外科研究所,昆明医科大学附属延安医院老年医学科,中国人民解放军联勤保障部队第920医院干部病房

    基金: 云南省基础研究计划(昆医联合专项)(2018FE001-276),云南省昆明市卫生科技人才培养千工程科研项目[2018SW(后备)06],昆明医科大学附属延安医院院内项目(yyky016-020)

    分类号: R346;Q78

    页码: 3970-3973

    总页数: 4

    文件大小: 1395K

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