一种基于智能设备辅助的核酸定量分析方法及其应用论文和设计-王辉

全文摘要

本发明提供一种基于智能设备辅助的核酸定量分析方法及其应用，所述方法通过设计构建由核酸目标物引发对pH敏感的核酸扩增反应体系，采用pH指示剂甲酚红，变色范围为黄色7.2‑粉红色8.8，实现肉眼对核酸的可视化快速分析；在此基础上，利用智能设备辅助的三原色图像扫描模式，以智能设备检测终端实现对核酸的快速检测及定量分析，所用到的智能设备包括智能手机、平板等具有拍照功能的智能设备。

主设计要求

1.一种基于智能设备辅助的核酸定量分析方法，其特征在于：所述方法用智能设备拍摄记录由核酸目标物所引发的核酸扩增反应体系的颜色的图片，然后对图片中核酸扩增反应三原色数值进行获取，建立三原色数值与核酸浓度之间的线性关系，通过该线性关系，用智能设备对核酸进行定量分析。

设计方案

2.根据权利要求1所述的核酸定量分析方法，其特征在于：所述扩增反应体系是pH敏感核酸扩增体系，扩增反应过程中产生H^{+<\/sup>引起体系pH变化，该变化引起pH指示剂颜色变化，并由此颜色变化裸眼识别核酸目标物的存在。}

3.根据权利要求2所述的核酸定量分析方法，其特征在于：所述pH指示剂在碱性pH和酸性pH有明显的颜色变化，所述pH指示剂为甲酚红、中性红、酚红或甲酚紫。

4.根据权利要求1所述的核酸定量分析方法，其特征在于：所述智能设备用于拍摄记录核酸扩增反应的颜色，并通过智能设备中的App读取核酸扩增反应三原色RGB数值。

5.根据权利要求4所述的核酸定量分析方法，其特征在于：所述读取的核酸扩增反应三原色RGB数值包括R、G、B值或归一化的B\/(R+G+B)、G\/(R+G+B)和R\/(R+G+B)；通过归一化的三原色数值B\/(R+G+B)、G\/(R+G+B)或R\/(R+G+B)消除核酸定量分析中由于拍摄记录条件不同而产生的误差。

6.根据权利要求5所述的核酸定量分析方法，其特征在于：G\/(R+G+B)与核酸浓度负对数之间存在线性关系。

7.根据权利要求1所述的核酸定量分析方法，其特征在于：所述智能设备为带有拍摄功能的智能手机、平板电脑或智能手环。

8.一种基于智能设备辅助的核酸定量分析方法的mRNA定量分析应用，基于上述权利要求1-7之一所述的核酸定量分析方法，其特征在于，所述mRNA定量分析应用包括：

S1：构建pH敏感的由mRNA启动的连接依赖的等温核酸扩增反应体系；

S2：在不同反应时间，利用智能设备对扩增反应的颜色进行拍照记录；

S3：通过图像处理App获取S2中图片的RGB颜色信息；

S4：构建颜色信息中RGB值与核酸浓度之间的线性关系；

S5：以S4中的线性关系为基础，利用智能设备对待测定样品中mRNA进行定量。

9.根据权利要求7所述的mRNA定量分析应用，其特征在于：所述S4中线性相关方程式为：

G\/(R+G+B)＝0.5078+0.0166lgCe_{13a2<\/sub>(M),[100pM-100fM]；}

G\/(R+G+B)＝0.7222+0.0331lgCe_{13a2<\/sub>(M)[100fM-100aM]。}

10.根据权利要求7所述的mRNA定量分析应用，其特征在于：所述S1构建等温核酸扩增反应体系包括：

S11：通过探针SLP-e13和探针SLP-a2的检测识别区分别与体系中mRNA特异性杂交；

S12：以mRNA为模板，利用SplintR连接酶将探针SLP-e13和探针SLP-a2连接起来形成双茎环结构DNA；

S13：以双茎环结构DNA作为环介导等温扩增反应的起始模板，引发扩增反应。

设计说明书

技术领域

本发明属于生物分析技术领域，具体涉及一种基于智能设备辅助的核酸定量分析方法及其应用，该方法是在低缓冲体系中进行核酸扩增反应，利用核酸扩增反应过程中产生H^{+<\/sup>离子引起体系pH变化，利用pH指示剂颜色变化对扩增体系进行监测，本发明利用智能设备(手机、平板等)中的App读取核酸扩增反应体系的颜色信息即图像三原色(红、绿、蓝)，建立三原色值与核酸浓度之间的关系，实现对核酸的简便、快速、高灵敏度、高特异性的定量分析。}

背景技术

简便、快速、高灵敏度、高特异性的核酸检测及定量分析在病原微生物、DNA\/RNA病毒、遗传疾病诊断、食品安全等领域中发挥着重要的作用。

目前研究者利用聚合酶链式反应(PCR)、环介导等温核酸扩增(LAMP)和链顶替扩增(SDA)扩增技术对目标DNA\/RNA进行扩增，利用pH指示剂，建立了可视化的核酸扩增产物检测体系，(BioTechniques,2015,58,59-68.)通过扩增反应前后的颜色变化鉴定目标DNA\/RNA的“阳性或阴性”，虽然实现了简便快速的目标DNA\/RNA的检测，但并不能实现定量分析。李等利用PCR、滚环扩增(RCA)和SDA扩增结合pH指示剂，通过测定扩增产物紫外可见光谱，由此实现了对miRNA的定量检测，(Anal.Chem.,2017,89,6631-6636.)尽管如此，这仍然需要额外的操作及测定步骤，容易造成扩增产物的污染，此外仍然需要昂贵的仪器设备。

智能手机不仅成是日常生活中必备的通讯工具，同样也为人们提供了高性能的拍照功能。利用智能手机拍照功能，便可以方便快捷的记录可视化的核酸检测结果；此外，智能手机为手机软件(App)提供运行环境，目前已有许多开源的App，如Pixel Picker，ColorPicker，PickColor等可以快速读取拍摄照片的三原色(红、绿、蓝)信息。基于图像三原色(红、绿、蓝)分析App，利用智能手机对核酸扩增反应颜色进行识别，建立三原色值与核酸浓度之间的关系，由此实现对核酸的简便、快速、高灵敏度、高特异性的定量分析，为以核酸分子为目标物的分子诊断分析、疾病诊断分析等提供新工具。

发明内容

本发明提供一种基于智能设备辅助的核酸定量分析方法，所述方法利用智能设备中的(智能手机或平板电脑等)App对核酸目标物所引发的pH敏感的核酸扩增反应体系的三原色(即RGB数值)信息进行快速识别并读取；首次发现归一化的RGB值(G\/(R+G+B))与核酸目标物浓度负对数之间存在良好线性关系，由此，利用智能设备，建立了简便、快速的核酸定量分析方法。

本发明中核酸定量分析方法的技术方案由以下步骤组成：

1、根据待检测的核酸序列，设计构建有核酸目标物引发的pH敏感的核酸扩增体系，其中核酸扩增体系可以是目前已经发展的任何一种基于DNA聚合酶的核酸扩增反应，如聚合酶链式反应(PCR)、滚环扩增反应(RCA)、环介导等温核酸扩增反应(LAMP)、连接介导聚合酶链式反应(L-PCR)、连接介导等温核酸扩增反应(LIEXA)等。

2、利用pH指示剂对核酸扩增反应进行监测，随着核酸扩增反应的不断进行，核酸扩增反应产生H^{+<\/sup>引起pH指示剂颜色变化，在适当的扩增反应时间下，通过扩增反应体系的颜色变化，利用裸眼就可以对核酸目标物进行识别；同时，利用智能设备的拍照功能可以方便的记录反应体系颜色变化的图像，通过智能设备中App获得图像的三原色RGB信息。}

3、将上述RGB信息与核酸浓度之间进行拟合，获得RGB值与核酸浓度之间的线性关系。

4、利用该线性关系对核酸进行定量分析。

进一步，一种基于智能设备辅助的核酸定量分析方法的mRNA定量分析应用，所述mRNA定量分析应用包括：

S1：构建pH敏感的由mRNA启动的连接依赖的等温核酸扩增反应体系；

S2：在不同反应时间，利用智能设备对扩增反应的颜色进行拍照记录；

S3：通过图像处理App获取S2中图片的RBG颜色信息；

S4：构建颜色信息中RGB值与核酸浓度之间的线性关系；

S5：以S4中的线性关系为基础，利用智能设备对待测定样品中mRNA进行定量。

进一步地，所述S4中线性相关方程式为：G\/(R+G+B)＝0.5078+0.0166lgCe_{13a2<\/sub>(M),[100pM-100fM，R2＝0.9943]；}

G\/(R+G+B)＝0.7222+0.0331lgCe_{13a2<\/sub>(M)[100fM-100aM，R2＝0.9979]。}

进一步地，所述S1构建等温核酸扩增反应体系包括：

S11：通过探针SLP-e13和探针SLP-a2的检测识别区分别与体系中转录本mRNA特异性杂交；

S12：以mRNA为模板，利用SplintR连接酶将探针SLP-e13和探针SLP-a2连接起来形成双茎环结构DNA；

S13：以双茎环结构DNA作为环介导等温扩增反应的起始模板，引发扩增反应。

本发明的有益效果如下：

1、本发明以智能手机、平板等为检测终端，相比于传统核酸定量分析，无需昂贵的定量分析仪器，分析成本低；

2、本发明无需要额外的操作步骤，只需要反应结束后对反应管用智能手机、平板等进行拍照，并对照片颜色信息进行分析即可实现核酸的定量分析，操作简便；

3、本发明以智能手机、平板等为检测终端，非常适用于临床快检及家庭化的诊断分析及检测；

4、本发明不仅限于实施例所陈述mRNA的定量分析，可以推广至基于扩增体系的所有核酸的定量分析。

附图说明

图1为本发明所建立的BCR-ABL融合基因mRNA定量检测标准曲线图；

图2为本发明具体实施方式中基于Vis-Fusion LIEXA方法的融合基因分析方案示意图；

图3为本发明具体实施方式中不同反应时间对应的各反应管颜色变化图；

图4为本发明具体实施方式中经过不同扩增反应时间后不同浓度的mRNA反应管的R值变化趋势图；

图5为本发明具体实施方式中经过不同扩增反应时间后不同浓度的mRNA反应管的G值变化趋势图；

图6为本发明具体实施方式中经过不同扩增反应时间后不同浓度的mRNA反应管的B值变化趋势图；

图7为本发明具体实施方式中经过不同扩增反应时间后不同浓度的mRNA反应管的G\/(R+G+B)值变化趋势图；

图8为本发明具体实施方式中分析方法特异性研究图；

图9为本发明具体实施方式中不同细胞中RNA定量检测结果图。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细描述。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用于解释本发明，并不用于限定本发明。相反，本发明涵盖任何由权利要求定义的在本发明的精髓和范围上做的替代、修改、等效方法以及方案。进一步，为了使公众对本发明有更好的了解，在下文对本发明的细节描述中，详尽描述了一些特定的细节部分。对本领域技术人员来说没有这些细节部分的描述也可以完全理解本发明。

下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，但不作为对本发明的限定。下面为本发明的举出最佳实施例：

如图1-图9所示，本发明提供一种基于智能设备(手机、平板等)辅助的RNA定量分析方法及其应用，所述方法通过设计构建对pH敏感的连接-LAMP扩增体系，采用pH指示剂(如甲酚红，变色范围为(黄色)7.2-8.8(粉红色))，实现肉眼对融合基因的可视化快速分析，在此基础上，利用智能设备(手机、平板等)辅助的三原色图像扫描模式，以智能设备(手机、平板等)检测终端实现对融合基因的快速检测及定量分析，本发明所述方法简称：Vis-Fusion LIEXA；并将该方法应用于实际样品中融合基因检测。

所述方法以智能设备(手机、平板等)为记录核酸反应颜色的载体，通过在对核酸在扩增反应中产生的H^{+<\/sup>，进行pH颜色变化记录，并对三原色数值进行读取，建立三原色数值与核酸浓度之间的拟合关系，通过该拟合关系，对智能设备(手机、平板等)记录的核酸反应颜色进行核酸定量分析，通过在对核酸在扩增反应中产生的H^{+<\/sup>，进行pH颜色变化记录具体为通过构建对pH敏感连接的等温核酸扩增体系，使核酸扩增反应过程中产生H+离子足够引起体系pH变化，该变化使得甲酚红pH指示剂颜色由粉色变为黄色，并由此颜色变化裸眼识别融合基因的存在，所述三原色数值与核酸浓度之间的拟合关系为G\/(R+G+B)的比值与mRNA浓度负对数之间呈线性关系。其中G\/(R+G+B)的比值与mRNA浓度负对数之间的线性相关方程式分别为。}}

所述方法包括：

S1：以现有的基于pH指示剂的DNA\/RNA核酸扩增体系为基础，优化扩增反应的时间；

S2：利用智能设备(手机、平板等)对扩增反应的颜色进行拍照记录；

S3：通过图像处理App获取照片中各个反应管的颜色信息；

S4：建立颜色信息中RGB值与核酸浓度之间的拟合关系；

S5：以S4中的拟合关系为基础，通过智能设备(手机、平板等)对核酸反应颜色进行拍照并读取颜色信息，实现核酸的定量分析。

所述S1中优化扩增反应时间的方法如下：

S11：通过探针SLP-e13和探针SLP-a2的检测识别区分别与目标转录本mRNA特异性杂交；

S12：以mRNA为模板，利用SplintR连接酶、T_{4<\/sub>RNA连接酶2或者其他RNA连接酶将探针SLP-e13和探针SLP-a2连接起来形成双茎环结构DNA；}

S13：以双茎环结构DNA作为等温指数扩增反应的起始模板，引发扩增反应。

所述S11中体系中核酸的转录本mRNA在特异性杂交前需要先进行定量检测，定量检测方法如下：在200μL离心管中加入2.0μL无核酸酶的水、1.0μL 2nmol\/L探针SLP-e13水溶液、1.0μL 2nmol\/L探针SLP-a2水溶液、5.0μL 2×连接反应混合液、1.0μL经过75℃2min退火的mRNA片段水溶液或RNA样品，混合均匀后在25℃保持20min完成连接反应，同时以1.0μL水来代替mRNA样品做空白对照实验,所述5.0μL 2×连接反应混合液为20mM MgCl _{2<\/sub>，2mMATP，20mM DTT，5units SplintR连接酶和100μM Tris-HCl,pH～8.5@25℃。}

所述探针SLP-e13的碱基序列为：

5′-CTTCCTTATTGATGGTCAGCTTTATCGTCGTGACTGTTTGTAATAGGAC AGAGCCCCGCACTTTCAGTCACGACGAT-3′；

探针SLP-a2的碱基序列为：

5′-CGACAGCAGAGGATTTGTTGTGTGGAAGTGTGAGCGGATTTTCCTCTGCTGTCGTTTTACTGGCCGCTGAAGGGCTT-3′；

其中探针SLP-a2的5′端修饰磷酸基团。

所述等温指数扩增反应在65℃下进行，扩增时间为16分钟。

实施例：BCR-ABL融合基因mRNA分析

以在慢粒性白血病(CML)临床诊断、治疗、预后所检测的分子标志物，BCR-ABL融合基因mRNA为RNA检测模型，根据先前授权专利(专利号：ZL201610316771.0)设计合成具有茎环结构DNA探针SLP-e13和SLP-a2，探针SLP-e13的碱基序列为5′-CTTCCTTATTGATGGTCAGCTTTATCGTCGTGACTGTTTGTAATAGGACAGAGCCCCGCACTTTCAGTCACGACGAT-3′(由宝生物工程(大连)有限公司提供)；

探针SLP-a2的碱基序列为5′-CGACAGCAGAGGATTTGTTGTGTGGAAGTGTGAGCGGATTTTCCTCTGCTGTCGTTTTACTGGCCGCTGAAGGGCTT-3′(由宝生物工程(大连)有限公司提供)，其中探针SLP-a2的5′端修饰磷酸基团。

如图2所示，根据该BCR-ABL融合基因mRNA序列，在BCR基因和ABL基因融合位点(Fusion junction)设计两个特异性的茎环结构DNA探针SLP-e13和SLP-a2，在SLP-e13和SLP-a2探针上分别包含能够特异性识别BCR基因第13号外显子和ABL基因第2号外显子的序列，同时两探针上包含等温指数扩增(IEXA)所需的引物序列；当存在BCR-ABL e13a2融合基因mRNA分子时，mRNA分子与探针特异性杂交，随后以mRNA为模板连接DNA探针被SplintR连接酶连接形成双茎环结构DNA模板，当存在引物、dNTPs和DNA聚合酶时候，该双茎环结构可以引发快速高效的IEXA扩增，该扩增反应类似于环介导等温核酸扩增反应的指数扩增。

在等温指数扩增反应过程中DNA聚合酶以待扩增分子(Template)作为模板，以dNTP作为原料，将dNTP分子掺入到DNA的3'末端而形成磷酸二酯键，同时释放出一个氢离子(H^{+<\/sup>)，当反应在低缓冲能力的溶液中进行时，产生的H^{+<\/sup>足够引起的体系pH变化，JonathanRothberg利用这个原理而设计了Ion Torrent半导体高通量测序系统(Nature,2011,475,348-352)。本发明中，通过构建对pH敏感连接-等温核酸扩增体系，使核酸扩增反应过程中产生H ^{+<\/sup>离子足够引起体系pH变化，该变化可以使得甲酚红pH指示剂颜色由粉色变为黄色，由此便可以通过颜色变化裸眼识别融合基因的存在；此外，利用智能设备(手机、平板等)对结果拍照，并用图像处理App对照片三原色RGB值(红Red、绿Green、蓝Blue)读取，研究建立了RGB值与融合基因浓度之间的定量关系，由此实现了对融合基因的检测及定量分析。}}}

采用上述策略定量检测BCR-ABL融合转录本mRNA的具体方法如下：

在200μL离心管中加入2.0μL无核酸酶的水、1.0μL 2nmol\/L探针SLP-e13水溶液、1.0μL 2nmol\/L探针SLP-a2水溶液、5.0μL 2×连接反应混合液(20mM MgCl _{2<\/sub>，2mM ATP，20mMDTT，5units SplintR连接酶和100μM Tris-HCl,pH～8.5@25℃)、1.0μL经过75℃2min退火的mRNA片段水溶液或RNA样品，混合均匀后在25℃保持20min完成连接反应。同时以1.0μL水来代替mRNA样品做空白对照实验。}

随后将2.0μL上述连接反应产物加入到18.0μL环介导等温扩增反应混合溶液中，其中环介导等温扩增反应混合溶液由8μL无核酸酶的水、10.0μL 2×热启动显色-环介导等温扩增反应混合液(100mM KCl，10mM(NH _{4<\/sub>)_{2<\/sub>SO_{4<\/sub>，10mM MgSO _{4<\/sub>，5mM dNTPs，0.2％Triton X-100，12units Bst WarmStart 2.0DNA聚合酶，200μM甲酚红和50μM Tris-HCl，1.2μM通用引物UP1(CGACAGCAGAGGATTTGTTGTGTGGAAGTGTGAGCGGA，由宝生物工程(大连)有限公司提供)，1.2μM通用引物UP2(ATCGTCGTGACTGTTTGTAATAGGACAGAGCCC CG CAC，由宝生物工程(大连)有限公司提供)。混合均匀后，在65℃下进行环介导等温扩增反应，扩增16分钟后，用设备(手机、平板等)拍照记录颜色变化。利用智能设备(手机、平板等)App读取不同浓度mRNA样品反应后的RGB值，绘制G\/(R+G+B)的比值与目标mRNA浓度负对数之间线性关系曲线，结果如图1。}}}}

随着mRNA浓度的增加经过扩增反应后，体系颜色变化更明显，且不同浓度梯度可以相互区分，同时，从图1中可以看出G\/(R+G+B)的比值与mRNA浓度负对数之间呈现良好的线性关系，线性相关方程式分别为为G\/(R+G+B)＝0.5078+0.0166lgCe13a2(M),[100pM-100fM，R^{2<\/sup>＝0.9943]和G\/(R+G+B)＝0.7222+0.0331lgCe13a2(M)[100fM-100aM，R^{2<\/sup>＝0.9979]。因此，本发明方法可以定量检测目标mRNA，同理，本发明方法也可以用于DNA的定量检测。}}

上述实施例结果如下：

1、扩增反应时间优化数据如图3所示，图3为不同反应时间对应的各反应管照片，其中每幅图中mRNA浓度从左到右依次为100pM,10pM,1pM,100fM,10fM,1fM,100aM,0，由于图片为黑白图片，从图中看不出颜色差异性变化，图中颜色较深的红色，颜色较浅的为黄色。

2、如图4-图7所示，为经过不同扩增反应时间后不同浓度的mRNA反应管的RGB值变化趋势图；在定量分析中建议采用归一化的RGB(G\/(R+G+B))值表示结果，这种表示方式能够有效消除拍照条件不同而引起定量误差。

3、定量曲线如图1所示，按照具体实施方式中步骤，优化Vis-Fusion LIEXA体系中等温扩增反应时间(16min)，并利用最优条件对方法的性能进行了考察，由图3可以看出，利用该方法可以可视化检测低至100aM BCR-ABL融合基因mRNA；同时利用智能设备(手机、平板等)辅助的RGB值读取模式，发现G\/(R+G+B)比值与BCR-ABL融合基因mRNA浓度之间存在良好线性关系，由此表明该方法可以在很宽的线性范围内对BCR-ABL融合基因mRNA进行准确地定量检测。

4、此外，我们对方法的特异性进行了考察，如图8和图9所示，用e13a2特异性的茎环结构DNA探针SLP-e13和SLP-a2同时对BCR-ABL e13a2具有同源序列的100fM e1a2，e14a2，e19a2和e13a2进行检测，结果如图8所示，只有e13a2产生了明显的颜色变化，表明该方法能够特异性检测目标融合基因转录本。同时我们用非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳对扩增后的产物进行分析，如图9只有e13a2产生了类似梯形的IXEA扩增产物条带，其他转录本都没有产生相应的扩增产物，这表明Vis-Fuison LIEXA方法完全依赖于以目标链为模板的连接反应产物所引发的IEXA扩增。进一步证明该方法在融合基因检测方面具有优越的特异性。最后，该方法被成功应用于Total RNA样本中BCR-ABL融合基因的检测及定量分析。

以上所述的实施例，只是本发明较优选的具体实施方式的一种，本领域的技术人员在本发明技术方案范围内进行的通常变化和替换都应包含在本发明的保护范围内。

设计图

一种基于智能设备辅助的核酸定量分析方法及其应用论文和设计

一种基于智能设备辅助的核酸定量分析方法及其应用论文和设计-王辉

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