PDCoV-PEDV二联灭活疫苗的初步研制及对小鼠的免疫原性研究

论文摘要

猪流行性腹泻病毒（Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV）引起的猪流行性腹泻是一种以呕吐、水样腹泻和脱水为特征的急性接触性肠道传染病,是严重制约养猪业发展的主要病毒性传染病之一。2010年以来,PEDV在我国各地猪群中大规模爆发,市场上以CV777毒株为抗原制备的疫苗免疫后效果并不理想,接种过该疫苗的猪场仍有此病的发生。除了饲养管理因素外,地方流行毒株的变异也可能是导致免疫失败的一个重要原因。2012年,猪丁型冠状病毒（Porcine deltaconoravirus,PDCoV）首次被我国香港学者发现,随后各省份也出现相关报道。PDCoV与PEDV同属冠状病毒,临床症状极相似,目前尚未有针对PDCoV的商品化疫苗出现。本研究基于PEDV和PDCoV河北分离株,试制猪丁型冠状病毒、猪流行性腹泻病毒二联灭活疫苗,同时接种Balb/c小鼠研究免疫原性。具体研究内容如下:为了提高灭活疫苗中抗原含量,本研究对PEDV和PDCoV的体外培养条件进行优化,分别从最佳病毒接种剂量、病毒吸附后维持液用量和最佳收毒时间三个方面进行探索。实验结果发现PEDV HB-HS株在接毒剂量为104.35TCID50/mL,添加8mL维持液并在接毒后60h收毒时收获病毒液病毒滴度达到105.91TCID50/mL。PDCoV HB-BD株在接毒剂量为104.52TCID50/mL,添加8mL维持液并在接毒后72h收毒时收获病毒液病毒滴度达到105.57TCID50/mL。在疫苗制备方面,实验中使用终浓度0.3%甲醛对两种病毒进行灭活,以白油Span为免疫佐剂制备成油包水（W/O）剂型二联灭活疫苗。灭活疫苗灭活后残余毒力、物理性状、无菌性和安全性检测结果均符合《中国兽药典》中的标准。为了评价疫苗免疫效果,利用pET-32a-PDCoV S1阳性表达质粒和pET-32a-PEDV S1阳性表达质粒,以原核表达系统表达了PEDV重组S1蛋白和PDCoV重组S1蛋白。分别以两个重组蛋白为抗原,经方阵滴定法确定抗原的最佳包被浓度,对反应条件进行优化后成功建立了检测小鼠血清中PEDV S1蛋白IgG抗体和PDCoV S1蛋白IgG抗体的间接ELISA方法。通过两种ELISA方法检测小鼠阴性血清,利用公式计算各自的阴阳性临界值,以检测血清样品OD450nm大于或等于阴阳性临界值时血清最大稀释倍数作为该待检血清的ELISA抗体效价。在疫苗免疫原性研究中,首先以不同免疫剂量二联灭活疫苗接种Balb/c小鼠,分别于首免前和首免后分阶段采血,测定血清中特异性抗体效价,绘制抗体消长曲线,根据抗体消长曲线确定疫苗最佳免疫剂量为0.2mL/只。在最佳免疫剂量不同灭活疫苗免疫原性检测结果中,二联灭活疫苗组PEDV ELISA抗体效价在首免后4w达到峰值（1:1006）,高于PEDV商品疫苗组（1:654）,低于PEDV灭活疫苗组（1:1252）,首免5w后抗体效价开始下降但二联灭活疫苗组抗体效价仍高于商品疫苗组。PDCoV ELISA抗体效价在首免后4w达到峰值（1:982）,低于PDCoV灭活疫苗组（1:1150）,首免后6w抗体效价仍处于高水平（1:870）,随后抗体效价开始快速下降。抗体消长曲线表明二联灭活疫苗组刺激小鼠产生的抗体水平要低于单相灭活疫苗组,这是由于在相同免疫剂量下,不同疫苗中有效抗原含量的差异造成的。综合实验数据表明实验中试制的PDCoV-PEDV二联灭活疫苗能够刺激小鼠产生高水平特异性抗体。

论文目录

• 摘要
• abstract
• 缩写词表
• 1 引言
•   1.1 猪流行性腹泻病毒概述
•     1.1.1 猪流行性腹泻概述
•     1.1.2 PEDV生物学特性
•     1.1.3 PEDV的培养特性
•     1.1.4 PEDV流行病学
•     1.1.5 PEDV的检测方法
•     1.1.6 PEDV疫苗的研究进展
•   1.2 猪丁型冠状病毒及其研究概述
•     1.2.1 猪丁型冠状病毒概述
•     1.2.2 PDCoV生物学特性
•     1.2.3 PDCoV培养特性
•     1.2.4 PDCoV流行病学
•     1.2.5 PDCoV的检测方法
•     1.2.6 PDCoV疫苗的研究进展
•   1.3 多联疫苗的研究进展和应用
•   1.4 研究目的及意义
• 2 材料与方法
•   2.1 材料
•     2.1.1 病毒、细胞系、菌株、疫苗
•     2.1.2 主要试剂和耗材
•     2.1.3 主要实验仪器
•     2.1.4 主要试剂和培养基的配置
•     2.1.5 实验动物
•   2.2 方法
•     2.2.1 猪丁型冠状病毒和猪流行性腹泻病毒培养条件的确定
•     2.2.2 猪丁型冠状病毒和流行性腹泻病毒液的制备
•     2.2.3 细胞毒的鉴定
•     2.2.4 猪丁型冠状病毒和猪流行性腹泻病毒TCID50 的测定
•     2.2.5 疫苗的制备
•     2.2.6 疫苗的检验
•     2.2.7 疫苗免疫原性检测方法的建立
•     2.2.8 猪丁型冠状病毒-猪流行性腹泻病毒二联灭活疫苗小鼠免疫实验
• 3 结果
•   3.1 猪丁型冠状病毒和猪流行性腹泻病毒培养条件
•   3.2 PDCoV和 PEDV的增殖曲线和最佳收毒时间
•   3.3 疫苗的制备
•     3.3.1 猪流行性腹泻病毒和猪丁型冠状病毒液的制备
•     3.3.2 病毒液的PCR鉴定
•     3.3.3 猪流行性腹泻和猪丁型冠状病毒TCID50 测定结果
•     3.3.4 病毒液的浓缩
•     3.3.5 猪流行性腹泻病毒液和猪丁型冠状病毒液的无菌检验及灭活检验
•   3.4 灭活疫苗的检验
•     3.4.1 灭活疫苗的物理性状检验
•     3.4.2 灭活疫苗的无菌检验及细胞病变检验
•     3.4.3 灭活疫苗的安全性检验
•   3.5 疫苗免疫原性检测方法的建立
•     3.5.1 重组蛋白的原核表达及重组蛋白的鉴定
•     3.5.2 间接ELISA方法的建立及优化结果
•     3.5.3 阴阳性临界值的确定
•   3.6 PEDV-PDCoV 二联灭活疫苗免疫原性实验
•     3.6.1 不同剂量二联灭活疫苗免疫小鼠后PEDV ELISA抗体的消长规律
•     3.6.2 不同剂量二联灭活疫苗免疫小鼠后PDCoV ELISA抗体的消长规律
•     3.6.3 不同灭活疫苗免疫效果差异
• 4 讨论
•   4.1 病毒培养和病毒液浓缩
•   4.2 二联灭活疫苗的制备
•   4.3 ELISA检测方法的建立
•   4.4 疫苗免疫原性
• 5 结论
• 参考文献
• 在读期间发表的学术论文
• 作者简介
• 致谢

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 侯林杉

导师: 范京惠

关键词: 猪丁型冠状病毒,猪流行性腹泻病毒,二联灭活疫苗,最佳免疫剂量,疫苗免疫原性研究

来源: 河北农业大学

年度: 2019

分类: 基础科学,农业科技

专业: 生物学,畜牧与动物医学

单位: 河北农业大学

分类号: S852.4

总页数: 57

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