王春梅赓迪徐宋瑶陈伟东(北京中医药大学中药学院生物制药系100102)
【中图分类号】R967【文献标识码】A【文章编号】2095-1752（2011）23-0117-03
【摘要】本实验研究暹罗鳄鳄鱼血粉对小鼠免疫功能的影响。采用6.4、1.6、0.4mg/kgbw剂量的鳄鱼血粉给小鼠经口灌胃30d，进行小鼠脾淋巴细胞增殖反应实验、单核巨噬细胞吞噬实验、NK细胞杀伤细胞实验。结果发现：与阴性对照组比较发现，鳄鱼血低、中、高剂量和猪血组能促进脾淋巴细胞增殖反应（P＜0.05）；鳄鱼血粉中、高剂量组能促进小鼠单核巨噬细胞吞噬能力（P＜0.05）；鳄鱼血粉中、高剂量组能提高小鼠NK细胞的杀伤能力（P＜0.05）。结论证明鳄鱼血粉具有增强免疫力的作用。
【关键词】鳄鱼血粉脾淋巴细胞增殖反应单核巨噬细胞吞噬指数NK细胞活性免疫功能
EffectsofCrocodylussiamensisbloodpowderonImmuneFunctioninMiceWangChun-Mei，GengDi，XuSong-Yao,ChenWei-Dong,(DepartmentofBiologicalPharmaceutics,SchoolofMateriaMedica,BeijingUniversityofChineseMedicine,Beijing,100102)
【Abstract】InordertostudytheeffectsofCrocodylussiamensisbloodpowderonimmunefunctionofnormalmice,lymphocytetransformationcapacityinducedbyConA,antibodyformingspleencells(AFPC),NKcellactivityweredeterminedaftermicewereorallyadministeredwiththeCrocodylussiamensisbloodpowderatdosesof6.4,1.6and0.4mg/kg.bwfor30days.Comparedwiththecontrolgroup,theCrocodylussiamensisbloodpowderatdoseof1.6mg/kg.bwcouldsignificantlyNKcellactivityandlymphocytetransformationcapacityinducedbyConAinmice（P＜0.05）.TheseresultsindicatethattheCrocodylussiamensisbloodpowdercanimproveimmunefunctioninmice.
【Keywords】theCrocodylussiamensisbloodpowderlymphocytetransformationcapacityphagositosisofperitonealmacrophagesNKcellactivityimmunefunction
随着鳄鱼人工养殖的成功，其价值得到多方面的开发，包括旅游观赏、餐饮加工、时装皮具等。自1999年Sharbanay报道海水鳄血清有抗菌活性以来，国外、国内许多学者对鳄鱼血的功效进行了研究，发现鳄鱼血具有抗菌、抗病毒、抗肿瘤等方面的作用[1-5]，鳄鱼血的这些功能是否是通过调节免疫来实现的呢？关于鳄鱼血的免疫增强作用尚未见报道。因此，本实验以小鼠为研究对象，探讨鳄鱼血对正常小鼠免疫功能的影响。
1材料与方法[6]
1.1材料与试剂
鳄鱼血采自人工养殖暹罗鳄(Crocodylussiamensis)，来源于海南三亚龙虎园养殖场，本试验室制备。
清洁级BALB/C小鼠，雄性，60只，18～22g。刀豆蛋白A(ConA)、染液、Hanks液(pH7.2～7.4)RPMI1640完全培养液、乳酸锂、碘硝基氯化四氮唑(INT)、吩嗪二甲酯硫酸盐(PMS)、NAD、Tris-HCl缓冲液(pH8.2)、1%NP40、台盼兰、1mol/L盐酸等。
1.2仪器与设备
5mm直径打孔器、显微镜、微量血凝试验板、离心机、酶标仪、96孔培养板、5%CO2培养箱、200目筛网、注射用墨汁、721型分光光度计。
1.4动物实验分组与剂量设定
实验动物用于2项实验，分别为碳廓清实验和脏器/体重实验、小鼠脾淋巴细胞转化实验。每项50只动物，分为5个组，每组10只动物，分别为对照组、4倍人体摄入量组、1倍人体摄入量组、0.25倍人体摄入量组和猪血对照组。1倍人体摄入量为400mg/天。灌胃体积为0.2ml/20gbw。
1.5指标测定
1.5.1ConA诱导的小鼠脾淋巴细胞转化实验
小鼠连续灌胃30d后，颈椎脱臼处死，无菌取脾，置于盛有适量无菌Hanks液的小平皿中，用镊子轻轻将脾撕碎，经200目筛网过滤，制成单细胞悬液，将细胞悬液分为两部分，用于ConA诱导的小鼠脾淋巴细胞转化实验。
用Hanks液洗涤细胞悬液2次，每次离心10min(1000r/min)，然后将细胞悬浮于1ml的完全培养液中，台盼兰染色计数活细胞数(在95%以上)，调整细胞浓度为3×106个/ml。将每份细胞悬液分两孔加入24孔培养板中，每孔1ml，一孔加75μlConA液作为实验，另一孔作为对照，置培养箱中培养72h。培养结束前4h，每孔吸去上清液0.7ml，加入0.7ml不含血清的RPMI1640培养液，同时加入MTT50μl/孔，继续培养4h。培养结束后，每孔加入1ml酸性异丙醇，吹打混匀，使紫色结晶完全溶解。然后分装到96孔培养板，每孔做3个平行孔，用酶标仪以570nm波长测定光密度值。以实验孔与对照孔OD的差值代表淋巴细胞增殖能力。
1.5.2小鼠NK细胞活性测定(乳酸脱氢酶LDH测定法)
实验前24h按常规培养靶细胞、效应细胞，取靶细胞和效应细胞各100μl(效靶比50:1)，加入96孔培养板中；靶细胞自然释放孔加靶细胞和培养液各100μl、靶细胞最大释放孔加靶细胞和1%NP40各100μl，上述各项均设三个复孔，于37℃、5%CO2培养箱中培养4h，然后将培养板1500r/min离心5min，每孔吸取上清液100μl置96孔培养板中，同时加入LDH基质液100μl，反应3min，每孔加入1mol/L的HCl30μl，在酶标仪490nm处测定光密度值(OD)。
1.4.3小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞实验(半体内法)
小鼠连续灌胃30d后，每鼠腹腔注射2%鸡红细胞悬液1ml。30min后，颈椎脱臼处死动物，仰位固定于蜡板上，正中剪开腹壁皮肤，经腹腔注入生理盐水2ml，转动鼠板1min，然后吸出腹腔洗液1ml，平均分滴于2片载玻片上，放入垫有湿纱布的搪瓷盒内，于37℃孵箱温育30min。孵毕，在生理盐水中漂洗，除去未贴片细胞。晾干，以1:1(V/V)丙酮甲醇溶液固定20min，4%(V/V)Giemsa-磷酸缓冲液染色3min，再用蒸馏水漂洗晾干，于显微镜下计数巨噬细胞。吞噬百分率与吞噬指数按以下公式计算。
1.5统计学方法
测定结果数据均用x±s表示，用SPSSl6.0软件对结果进行t检验统计学处理，P＜0.05为差异有显著性意义。对于NK细胞杀伤活性的实验，结果采用秩和检验分析。
2结果
2.1鳄鱼血粉对小鼠脾淋巴细胞转化的影响
结果显示：鳄鱼血各个剂量组均能促进小鼠淋巴细胞的转化（P<0.05），且随着剂量增加呈现线性关系。见表1
表1鳄鱼血粉对ConA诱导后OD值的影响
注：*与正常组比较，P<0.05。△，与正常组比较，P<0.01
2.2鳄鱼血粉对小鼠单核巨噬细胞功能的影响
结果显示：中剂量组与高剂量组的鳄鱼血粉均能提高小鼠单核巨噬细胞的功能（P<0.05）。见表2
表2对小鼠单核巨噬细胞功能的影响
注：*与正常组比较，P<0.05。
2.3鳄鱼血粉对小鼠NK细胞杀伤能力的影响
结果可知，鳄鱼血粉中高剂量均能促进小鼠NK细胞的细胞杀伤能力。见表3
表3对小鼠NK细胞活性的测定结果
*经秩和检验，P<0.05，上述各组具有统计学差异。
3讨论
鳄鱼血粉0.4、1.6、6.4mg/kgbw脾淋巴细胞转化实验呈阳性结果；小鼠单核-巨噬细胞功能实验结果表明，小鼠巨噬细胞吞噬鸡红细胞实验表明，高剂量组的吞噬指数显著高于对照组，呈阳性结果；NK细胞活性测定实验表明，与对照组比较，中、高剂量组NK细胞的活性显著升高，呈阳性结果。由以上结果表明鳄鱼血粉具有增强小鼠免疫力功能。
参考文献
[1]SharbanayM,GollopN,RavinS,eta1.Naturallyoccurringantibacterialactivitiesofavianandcrocodiletissues[J].JAntimicrobChemother,1999,44:416～418．
[2]MerchantM,ThibodeauxD,LoubserK,etal.AmoebacidaleffectsofserumfromtheAmericanalligator(Alligatormmississippiensis)[J].Parasitol,2004,90:1480～1483.
[3]MerkEMerchant,NoelleLeger,ErinJerkins,etal.BroadspectrumantimicrobialactivityofleukocyteextractsfromtheAmericanalligator(Alligatormmississippiensis)[J].Veterinaryimmunologyandimmunopathology,2005,5:221～228.90(9):4266～4270.
[4]许东晖,马海萍,梅雪婷,许实波.鳄鱼血浆体外抗菌实验研究[J].中国海洋药物,2008,(1):33～39.
[5]邹黎黎,罗永煌,郝娟,梁桂英,李安兴.暹罗鳄外周血白细胞提取物抗海豚链球菌感染的效果[J].中国兽药杂志,2008,(5).
[6]徐叔云,卞如濂,陈修药理实验方法学第三版人民卫生出版社2002.