光镊研究rpoS RNA自抑制茎环

论文摘要

生物大分子的结构及其动态变化是一切生命现象的物质基础。在分子水平上对生物大分子结构与功能进行研究,阐释生命现象的本质,对人类认知世界与自身都有重大意义。本论文系统地调研光镊技术研究单分子的不同实验方案,并针对多种分子生物学体系进行研究,在前人基础上提出本研究的目的和实验方法。取得主要研究成果如下:1.建立高精度、高稳定的光镊拉伸单分子实验装置。光镊对位移及外力的测量精度与系统的稳定性决定了适合研究的体系。为了提高原光镊系统的稳定性,本研究采取引入探测光以提高测量精度;利用对粘底微球的图像识别,实现反馈补偿系统漂移等多项措施,创造优良的系统稳定性。为顺利完成单分子测量,我们发展了单分子样品的制备、分子偶联等技术。2.研究rpoS RNA自抑制茎环结构。本文利用光镊对rpoS RNA的自抑制茎环进行拉伸得到了稳定重复的RNA“力-伸展”曲线。通过对RNA“力-伸展”曲线的分析,得到rpoS RNA自抑制茎环结构被打开的动力学过程,证实其three-way-junction结构,计算了RNA关键核心部分的自由能。实验发现镁离子明显提高了自抑制茎环核心部分的结合强度,由此推测镁离子会促使RNA结构变得更加紧密并改变茎环的空间取向。这一结构变化客观上拉近了D1和D2茎环之间的距离,方便Hfq蛋白帮助sRNA结合在SD区域上,从而解除基因表达的自抑制。3.研究GSK、Syntelin抑制CENP-E行走机理。光镊研究CENP-E行走的动力学特性,发现其平均运动速度低于kinesin-1蛋白,行走一段距离后会“休息”片刻。实验结果表明GSK阻断了CENP-E行走时ATP水解为ADP的过程,从而实现对CENP-E行走的抑制。依据实验现象,我们推测Syntelin是通过阻碍CENP-E·ADP从微管上解离,从而抑制了CENP-E运动。4.研究CENP-T与CENP-W蛋白间相互作用强度。本文提出了一种将CENP-T或CENP-W连接在DNA手柄一端,再通过手柄另一端偶联在微球上的方案。通过这一策略我们测量了CENP-T/W之间的断裂力,直接从单分子水平上研究磷酸化对CENP-T/W蛋白结合强度的影响。5.为了实现对流动细胞的动态相位成像,本文提出了一种基于单像素的相位成像方法。通过动态加载不同波矢的平面波采集物体的傅里叶频谱,借助逆傅里叶变换对物体的振幅与相位分布进行重构。实验测试了二值化相位分布与连续相位分布,均得到良好的重构效果。本文建立了高精度、高稳定性的光镊研究生物单分子力学特性实验平台,并通过一系列生物物理交叉问题的研究证实了这一平台在生命科学领域的价值。研究取得的结果在生命科学基本问题、医学应用等方面都具有一定贡献,为使用光镊进行深入的分子生物学研究奠定了基础。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第1章 绪论
•   1.1 单分子光镊技术现状与进展
•     1.1.1 单光镊法
•     1.1.2 微针-光镊法
•     1.1.3 双光镊与多光镊法
•     1.1.4 高通量单分子光镊
•     1.1.5 荧光光镊
•     1.1.6 FRET光镊
•   1.2 光镊研究DNA
•     1.2.1 DNA过拉伸
•     1.2.2 核小体
•   1.3 光镊研究RNA结构
•     1.3.1 光镊研究RNA方法
•     1.3.2 rpoS RNA
•   1.4 光镊研究驱动蛋白
•     1.4.1 CENP-E与微管
•     1.4.2 驱动蛋白行走步骤
•     1.4.3 驱动蛋白解离力
•     1.4.4 GSK对CENP-E的抑制机理
•   1.5 光镊研究蛋白结构与相互作用
•     1.5.1 光镊研究SNARE蛋白结构
•     1.5.2 CENP-T/W蛋白
•   1.6 单像素成像技术
•   1.7 本文主要研究内容
• 第2章 纳米级光镊系统的稳定性研究
•   2.1 光镊系统设计
•     2.1.1 低噪声探测光路
•     2.1.2 原位电压系数和光阱刚度标定
•     2.1.3 反馈补偿系统的漂移
•   2.2 生物实验测试
•     2.2.1 DNA拉伸相变曲线
•     2.2.2 溶液粘滞系数测量
•     2.2.3 细胞的功率谱标定
•   2.3 样品室底面修饰
•   2.4 光镊系统控制程序设计
•   2.5 本章小结
• 第3章 光镊研究rpoS RNA自抑制茎环结构
•   3.1 拉伸实验方案
•   3.2 rpoS RNA样品制备
•     3.2.1 模板DNA制备方法与流程
•     3.2.2 转录rpoS RNA流程
•     3.2.3 DNA手柄制备
•     3.2.4 RNA/DNA手柄退火
•     3.2.5 样品室内样品制作
•   3.3 rpoS RNA的力谱特性
•     3.3.1 拉伸曲线打开长度计算
•     3.3.2 rpoS RNA自抑制茎环的打开路径
•     3.3.3 蠕虫链模型
•     3.3.4 rpoS RNA的蠕虫链模型拟合
•   3.4 rpoS RNA自抑制茎环折叠自由能
•     3.4.1 MFold预测自抑制茎环折叠自由能
•     3.4.2 “力-伸展”曲线计算自抑制茎环折叠自由能
•     3.4.3 自抑制茎环局部结构自由能计算
•   3.5 镁离子对ropS RNA自抑制茎环的影响
•     3.5.1 小角X射线散射结果（生物合作）
•     3.5.2 原子力显微镜结果
•     3.5.3 镁离子对自抑制茎环核心部分的影响
•     3.5.4 镁离子对自抑制茎环的影响
•   3.6 本章小结
• 第4章 光镊研究着丝粒相关蛋白
•   4.1 CENP-E与其小分子抑制剂研究
•     4.1.1 样品制备与观察
•     4.1.2 K560与CENP-E动力学特性
•     4.1.3 GSK与Syntelin抑制机理研究
•     4.1.4 CENP-E突变体动力学特性
•   4.2 CENP-T/W间相互作用
•     4.2.1 CENP-T/W偶联方案
•     4.2.2 CENP-T/W拉伸方案
•     4.2.3 力谱曲线分析
•   4.3 本章小结
• 第5章 单像素相位成像
•   5.1 优化的Lee算法
•     5.1.1 Lee方法编码复杂光场
•     5.1.2 优化的Lee方法
•     5.1.3 仿真结果
•     5.1.4 实验结果
•     5.1.5 基于OAM模式的信息编码
•   5.2 单像素相位成像
•     5.2.1 单像素相位成像原理
•     5.2.2 单像素相位成像实验
•     5.2.3 单像素相位成像结果
•   5.3 本章小结
• 第6章 总结与展望
•   6.1 论文总结
•   6.2 工作展望
• 参考文献
• 致谢
• 博士期间发表的学术论文与其他研究成果

文章来源

类型: 博士论文

作者: 呼新尧

导师: 郭光灿,李银妹

关键词: 光镊,结构,驱动蛋白,小分子抑制剂,蛋白相互作用,复杂光场调制,单像素成像

来源: 中国科学技术大学

年度: 2019

分类: 基础科学

专业: 生物学,生物学

单位: 中国科学技术大学

分类号: Q752

总页数: 123

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