导读:本文包含了多顺反子论文开题报告文献综述、选题提纲参考文献及外文文献翻译，主要关键词:顺反子,转染,干细胞,质粒,病毒,细胞,禽类。
多顺反子论文文献综述
吴立柱,安叶芝,张洁,孙天杰,王冬梅[1]（2019）在《基于核糖体跳跃的多顺反子共表达技术在拟南芥上的应用》一文中研究指出2A肽的核糖体跳跃技术是一种新型技术。其2A肽是长度为18～22个氨基酸的顺式作用水解酶元件,具有结构短小、蛋白分割效率高的特点,因而被越来越多应用于多顺反子表达载体的构建中。该项技术目前主要集中于酵母(Saccharomyces cerevisiae)和哺乳动物细胞的研究中,在植物中的报道较少。为探索该技术在植物中的应用研究,本研究利用猪捷申病毒2A (Porcine teschovirus-1 2A, P2A)和东亚细亚病毒2A (Thosea asigna virus 2A, T2A),首次将人工合成的转录因子XVE (X, the DNA-binding domain of the bacterial repressor LexA; V, the acidic transactivating domain of VP16; E, the regulatory region of the human estrogen receptor)、绿色荧光蛋白基因(green fluorescent protein, GFP)和抗除草剂基因(bialaphos resistance,Bar)3个基因的开放阅读框(open reading fragment, ORF)串联后受35S启动子调控,构建成多顺反子共表达载体pX6-2A,转化拟南芥(Arabidopsis thaliana)后经PCR鉴定获得了转基因阳性植株;Western blot结果显示XVE,GFP和Bar 3个目的蛋白全部被分割完成,说明P2A和T2A肽在植物材料中可以转录、表达和翻译,且在分割过程中不会互相干扰,是一种理想的多顺反子表达方式。本研究结果表明P2A和T2A在植物材料中能够完成高效分割,行使其"核糖体跳跃"的功能,适用于在植物材料中的应用研究,该研究结果对2A肽在转基因植物中的推广应用具有重要的理论和借鉴意义。(本文来源于《农业生物技术学报》期刊2019年07期）
刘琳[2]（2016）在《禽类多瘤病毒晚期基因多顺反子翻译起始调控的初步研究》一文中研究指出为了研究禽类多瘤病毒(Avian polyomavirus,APV)晚期基因多顺反子翻译起始调控机制,Agno-1a前导蛋白对下游VPs蛋白合成的调控机制的影响作用。设计构建一系列新型cDNA重组病毒,在agno-1a mRNA编码序列的ATG区域,设计插入一个和插入两个含有ATG的最佳翻译起始信号的7个氨基酸in-frame片段。在agno-1a编码mRNA序列的ATG区域,设计PCR点突变,使起始密码子ATG变成ACG或CTG,从而关闭agno-1a的翻译并可能改变关键mRNA二级结构,形成ATG突变型重组克隆。片段插入型克隆:SDS碱裂解法,提取APV cDNA克隆pHL1003质粒DNA,用限制性内切酶Acc I部分酶切,得到回收的载体片段,人工合成的27bp DNA并磷酸化的目的片段,经T4连接酶与载体片段连接,筛选阳性重组质粒,通过测序验证,得到片段插入型cDNA克隆pHL1003+1、pHL1003+2。点突变型克隆:用限制性内切酶Nco I完全酶切和Acc I部分酶切pHL1003质粒DNA,得到载体片段,设计PCR点突变起始密码子ATG变为ACG和CTG的目的片段,与载体片段连接,筛选阳性克隆测序验证。设计构建GFP为下游报告基因荧光标记的APV-1晚期基因真核双顺反子表达载体,以EGFP报告基因替代野生型病毒APV-1编码晚期结构蛋白VPs基因的碱基序列。pHL1003质粒DNA为模板,PCR扩增出与野生型病毒APV-1相同的Ori区、早期编码区和晚期agno-1a区序列,作为载体片段,载体片段黏性末端补齐平末端连接后,得到重组质粒pHL1003-1(可作为Agno-1a蛋白表达质粒)。质粒DNA pEGFP-N1为模板,PCR扩增出编码绿色荧光蛋白的EGFP片段,作为目的片段与上述载体片段经T4连接酶连接,构成重组质粒pHL1003-GFP,测序验证。用限制性内切酶NruI和NedI双酶切pHL1003+1、pHL1003+2和pHL1003-GFP,得到目的片段和载体片段连接,构建pHL1003+1-GFP,pHL1003+2-GFP克隆。通过磷酸钙和脂质体的转染方法,将构建成功的cDNA突变型质粒DNA,分别定量转染到鸡胚和鹌鹑胚胎成纤维细胞中,分别利用Western blot和荧光显微镜观察检验。Western blot结果显示出部分特异性条带,荧光显微镜观察转染72 h后的鸡胚和鹌鹑胚胎成纤维细胞,转染成功胚胎细胞明显表达较强的荧光。结果表明,GFP荧光标记的APV-1真核双顺反子cDNA表达载体在鸡胚和鹌鹑胚胎成纤维细胞中正常表达了GFP蛋白并产生荧光。转染实验过程中,对转染过程的时间,转染质粒DNA的用量和转染过程中培养基pH等方面条件不断优化,提高了转染效率。根据不同质粒DNA组合转染不同染禽类胚胎原代细胞及其荧光表达量的差异的结果分析提示,在APV晚期基因多顺反子上游基因插入额外起始密码ATG会影响下游顺反子的翻译;Agno-1a蛋白对其下游基因翻译起始起重要的正调控作用。(本文来源于《中南民族大学》期刊2016-06-01）
李劲,刘琳[3]（2016）在《禽类多瘤病毒APV-1晚期基因多顺反子的EGFP标记载体构建和表达》一文中研究指出为研究禽类多瘤病毒晚期基因多顺反子翻译起始调控的机制,设计和构建了以增强绿色荧光蛋白(EGFP)报告基因替代病毒APV-1野生型的晚期结构蛋白VPs基因的真核双顺反子表达载体,并观察其在转染进入禽类原代成纤维细胞中的表达翻译状态.以APV-1的c DNA克隆(p HL1003)为模板,运用PCR技术扩增出与野生型病毒APV-1相同的Ori区、早期编码区和晚期Agno-1a区序列作为载体片段;从质粒p EGFP-N1中扩增出编码绿色荧光的EGFP DNA片段;经连接构成重组质粒p HL1003-GFP,通过脂质体细胞转染方法将质粒DNA转染到鸡胚胎和鹌鹑胚胎成纤维细胞中,通过细胞培养观察荧光表达状况.DNA序列分析证实了重组克隆中的EGFP序列与已知的质粒p EGFP-N1中EGFP序列一致.转染72 h后观察鸡和鹌鹑胚胎成纤维细胞,转染成功胚胎细胞明显表达较强的荧光,说明GFP可以在构建的双顺反子重组质粒的下游中正常表达并产生荧光.p HL1003-GFP重组质粒的构建及其在禽类原代成纤维细胞中的高效表达,为我们研究多顺反子翻译起始调控中Agno-1a基因的表达对下游病毒结构蛋白基因的翻译调控机制提供了简洁易用的系统和模型.(本文来源于《中南民族大学学报(自然科学版)》期刊2016年01期）
戴红林[4]（2016）在《莱茵衣藻叶绿体内多顺反子高效表达体系的建立》一文中研究指出莱茵衣藻因叶绿体表达系统相较于大肠杆菌、酵母等表达系统具有很多优势,一直被认为是理想的生物反应器,然而衣藻叶绿体中多基因操纵子表达量较低一直是束缚衣藻商业化生产重组蛋白的限制条件。在这项研究中我们致力于寻找一种基因问表达调控元件(IEE,intercistronic expression element),其为一段短的序列,通常在基因间隔区,转录后可形成RNA茎环二级结构,增强mRNA稳定性,将多顺反子高效地处理成稳定的单顺反子,从而赋予下游顺反子的可翻译性。它同时提供了一个新的通用工具,用于叶绿体中多个外源基因堆迭,实现多种蛋白同时表达,提高质体转基因表达的成功率,有助于扩大叶绿体转化技术的应用。本论文的主要内容及结果如下：(1)提取莱茵衣藻总DNA,从总DNA中克隆出衣藻内源性启动子PpsbA,终止子,同源序列,构建了莱茵衣藻"aadA表达盒”,作为后续实验的对照质粒。(2)以莱茵衣藻总DNA为模板,扩增出了两个潜在的基因间表达处理元件(IEE, intercistronic expression element),与本试验前期克隆的表达壮观霉素抗性基因aadA和表达卡那霉素抗性基因nptⅡ-起成功地构建了两个衣藻叶绿体双顺反子测试表达载体。(3)通过玻璃珠法、电击法及基因枪法将载体转入到莱茵衣藻叶绿体中,优化电击转化的电场强度,及筛选转化子的最佳抗生素浓度,发现最佳电场强度为1000V,最低壮观霉素浓度为100μg/mL,卡那霉素浓度为50μg/mL。(4)通过壮观霉素筛选及反复继代培养,获得转基因藻株,并经过卡那霉素抗生素筛选,初步表明IEE已发挥作用,但在PCR分子水平检测上还存在些问题,质粒在叶绿体中的存在方式等确切结论还有待进一步研究。(本文来源于《南京理工大学》期刊2016-01-01）
杨兴春,白转丽,王瑞,柏宏亮[5]（2015）在《共表达NEP1-40和PRP-1多顺反子重组scAAV的构建》一文中研究指出目的:构建共表达NEP1-40和PRP-1多顺反子重组双链腺相关病毒(scAAV)。方法:PCR扩增NEP1-40、PRP-1及FMDV2A的cDNA,建立NEP1-40-FMDV 2A-PRP-1嵌合肽cDNA。两端加入Flag肽和6×His肽后合成融合基因cDNA,克隆到PES载体构建出重组质粒PES/NEP1-40-FMDV 2A-PRP-1。双酶切重组质粒PBV220-NT4-NAP和PES/NEP1-40-FMDV 2A-PRP-1,连接得到重组质粒pBV220-NT4/NEP1-40-FMDV 2A-PRP-1。以腺相关病毒pSS-CMV构建双链腺相关病毒穿梭质粒ssAAV pSSHG-NT4/NEP1-40-FMDV 2A-PRP-1。经细胞内同源重组得到共表达NEP1-40和PRP-1的重组双链腺相关病毒scAAV pSSHG-NT4/NEP1-40-FMDV 2A-PRP-1。测定病毒滴度并利用鸡胚背根神经节检测其生物活性。结果:克隆了共表达NEP1-40和PRP-1的多顺反子融合基因cDNA,基因测序及核苷酸序列同源性比较结果与设计序列一致;构建了重组质粒pBV220-NT4/NEP1-40-FMDV 2A-PRP-1,酶切鉴定、核酸序列测定结果与理论值一致;重组的双链腺相关病毒scAAV pSSHG-NT4/NEP1-40-FMDV 2APRP-1应用于鸡胚背根神经节显示明显促进神经突起生长。结论:成功构建了共表达NEP1-40和PRP-1的重组双链腺相关病毒scAAV pSSHG-NT4/NEP1-40-FMDV 2A-PRP-1,并显示出促进鸡胚背根神经节神经突起生长作用。(本文来源于《陕西医学杂志》期刊2015年03期）
罗海钊,孙嘉,陈容平,刘艳,张如意[6]（2013）在《多顺反子转染小鼠原代肝细胞重编程为胰岛分泌细胞的研究》一文中研究指出目的:探讨非病毒法介导Pdx-1、Ngn3、MafA诱导肝细胞重编程为胰岛素分泌细胞(Insulin-producing cells,IPCs)的可行性。方法:构建共表达胰岛发育关键基因Pdx-1(胰十二指肠同源框因子1)、Ngn3(神经源素3)、MafA(肌腱膜纤维肉瘤癌基因同源基因A)的多顺反子载体pcDNA3.1(+)-MafA ORF-Ngn3 3‘UTR-Pdxl 3‘UTR(MNP),及对照组载体{pcDNA3.1(+)-MafA ORF(M)、pcDNA3.1(+)-Ngn3(本文来源于《中华医学会第十二次全国内分泌学学术会议论文汇编》期刊2013-08-21）
曲鑫建,刘天庆,宋克东,李香琴,葛丹[7]（2013）在《多顺反子质粒重编程人脂肪干细胞为诱导多能干细胞》一文中研究指出为建立多顺反子质粒载体转染技术获得人脂肪干细胞(adipose stem cells,ASCs)来源的诱导多能干细胞(inducedpluripotency stem cells,iPSCs),应用2A元件连接Oct4/Sox2/KLF4/c-Myc四因子基因,构建为单一开放阅读框的多顺反子质粒载体.使用该质粒对ASCs进行转染及重编程为iPSC.采用形态学观察、特异性抗体免疫荧光鉴定、体外拟胚体诱导分化和体内畸胎瘤形成等方法进行鉴定.结果显示,ASCs成功重编程为iPSCs,具有与人胚胎干细胞相似的形态学及多向分化潜能;通过拟胚体和畸胎瘤实验证实iPSCs能在体内外分化成叁胚层细胞;DNA印迹实验显示质粒载体序列未整合至iPSCs基因组中.因此,通过多顺反子质粒载体重编程技术成功建立的人iPSCs具有多向分化潜能,可减免发生插入突变和免疫排斥问题,为iPSCs在遗传性或退行性疾病的治疗奠定了实验基础.(本文来源于《生物化学与生物物理进展》期刊2013年05期）
罗海钊[8]（2013）在《多顺反子转染小鼠原代肝细胞重编程为胰岛素分泌细胞的研究》一文中研究指出[背景]糖尿病,是一组以慢性血葡萄糖(简称血糖)水平升高为特征、具有多种表现形式的临床综合征。随着经济的快速发展,生活方式的改变以及人口老龄化的加剧,使得我国糖尿病患病率快速攀升。目前,我国成人糖尿病发病率约为9.7%,总数约有9000万,而糖调节受损的患病率更是接近15%之多。糖尿病已成为继恶性肿瘤、心血管疾病之后第叁大威胁人类健康的慢性非传染性疾病,严重影响着患者生存质量以及寿命,并给社会带来沉重的负担。如何有效控制糖尿病及其并发症是当前医学领域中一个亟待解决的世界性难题。根据现有的研究结果显示,胰岛β细胞遭受破坏,致其功能缺陷、数量减少乃至缺失所引起的胰岛素分泌相对或绝对缺乏是糖尿病发病机制的核心环节。糖尿病的传统治疗方法包括控制饮食、体育锻炼、口服降糖药及注射胰岛素治疗等,然而这些治疗方法均无法治愈糖尿病,也不能从根本上阻止糖尿病相关并发疾病的发生和发展。患者迫切需要一种能从根本上控制糖尿病及其并发症的治疗手段。自上个世纪开始,科学家们相继发展了胰腺、胰肾联合移植和胰岛细胞移植技术替代功能丧失的胰岛,并取得了一定的疗效。本世纪之初,“埃德蒙顿方案”的成功更是曾经使人们将其视为前景无限的治愈糖尿病的方法。但是,受到供体细胞来源极度匮乏和终身免疫抑制治疗及其可能带来的副作用的严重制约,胰岛移植没有得到临床的广泛应用。通过安全有效的技术诱导来源充足的自体非胰岛细胞转化或转分化为胰岛素分泌细胞,能同时解决上述两大问题,因此被认为是目前根治糖尿病较有前景的策略之一。在细胞来源的选择上,国内外学者曾先后尝试利用了胚胎干细胞、成体干细胞。然而,胚胎干细胞面临致瘤性及激烈的伦理学问题；另一方面,成体干细胞的应用同样也受制于其分离纯化困难、分化率低等缺点。近年来,陆续有文献报道研究人员利用细胞直接重编程技术将肝细胞转分化为胰岛素分泌细胞,其胰岛素分泌具有接近生理状态的葡萄糖依赖性,并能改善链脲佐菌素处理后小鼠的血糖。此方法优势在于：第一,在胚胎发育过程中,肝脏与胰腺共同来源于内胚层,两者这间的转化涉及相对少的表观基因改变；第二,肝脏具有强大的修复与再生能力,能为胰岛素分泌细胞的转分化提供大量的细胞来源。但是由于原有的诱导方法多以腺病毒、腺相关病毒或者是慢病毒等病毒为载体,操作流程繁复,并且存在致肿瘤、容易引起免疫反应等风险。故此,采用非病毒载体实现胰岛细胞再生已成为必然的选择。质粒pcDNA3.1(+)拥有多克隆位点,以此为骨架构建的多顺反子载体能携带多个外源基因,并能高效稳定地实现多个基因的共同表达。与其他非病毒转染技术相比,此法具有靶细胞损伤小、操作简便、效果稳定的特点。最近的研究提示,在1100多个与胰腺发育相关的基因中筛选出胰十二指肠同源框因子1(Pancreatic and duodenal homeobox factor1, Pdx-1)、神经原素3(Neurogenin3, Ngn3)与肌腱膜纤维肉瘤癌基因同源基因A (Musculoaponeurotic fibrosarcoma oncogene homolog A,MafA)组合能最有效地诱导分化成熟的非胰岛细胞转分化为胰岛素分泌细胞。我们前期研究证明,多顺反子质粒载体共表达Ngn3+Pdx-1+MafA能诱导小鼠胎肝细胞系BNL CL.2表现出胰岛β细胞的特征。为进一步探讨诱导肝细胞转分化为胰岛素分泌细胞并自体移植的可行性,以期解决胰岛移植细胞来源匮乏及免疫排斥的双重难题,我们提出：多顺反子质粒载体共表达Ngn3+Pdx-1+MafA能诱导原代肝细胞向胰岛素分泌细胞转分化的设想。本研究以小鼠原代肝细胞作为研究对象,采用pcDNA3.1(+)为骨架,成功构建叁顺反子载体pcDNA3.1(+)-MafA ORF+ngn33'UTR+pdx-13’UTR,利用转染试剂Lipofectamine2000为媒介,实现了Pdx-1.MafA及Ngn3在原代肝细胞内的异位共表达,并能从基因和蛋白水平上证实胰岛素分泌细胞的存在。[目的]1.构建以pcDNA3.1(+)为骨架的质粒载体共表达小鼠胰岛发育的叁个关键基因Ngn3,Pdx-1,MafA.2.将上述载体转染至小鼠原代肝细胞内,并证实肝细胞转化为胰岛素分泌细胞,为下一步肝细胞转分化为胰岛素分泌细胞的自体移植研究奠定理论及技术基础。[方法]1.构建以pcDNA3.1(+)为骨架的载体pcDNA3.1(+)-MafA ORF+ngn33' UTR+pdx-13'UTR.pcDNA3.1(+)-ngn3ORF+pdx-13'UTR.pcDNA3.1(+)-MafA ORF+ngn33'UTR.pcDNA3.1(+)-MafA ORF.pcDNA3.1(+)-ngn3ORF以及pcDNA3.1(+)-pdx-1ORF并进行测序、鉴定。2.逆向原位胶原酶灌注法获得小鼠原代肝细胞并培养。3.实验共分7个组,以Lipofectamine2000为转染介质,实验组转染载体pcDNA3.1(+)-MafA ORF+ngn33'UTR+pdx-13'UTR,对照组6组分别转染上述其余5个载体以及空载体至原代肝细胞。4.通过荧光定量PCR及蛋白免疫印迹法、酶联免疫吸附法对转染后的细胞进行基因水平和蛋白水平的检测。比较不同组间胰岛相关基因、蛋白表达以及C-肽、胰岛素分泌量。[结果]1.构建了以pcDNA3.1(+)为骨架的载体pcDNA3.1(+)-MafA ORF+ngn33'UTR+pdx-13'UTR、pcDNA3.1(+)-ngn3ORF+pdx-13'UTR、pcDNA3.1(+)-MafA ORF+ngn33'UTR、pcDNA3.1(+)-MafA ORF、pcDNA3.1(+)-ngn3ORF以及pcDNA3.1(+)-pdx-1ORF,测序结果显示所获得的基因序列与Genebank报道的基因序列一致,证实该载体构建成功。2.按照逆向原位胶原酶灌注法获取的肝小鼠原代细胞经过Lipofectamine2000的转染并培养后,转染率约30%。3.逆转录PCR提示各转染组中均有对应的目的基因表达。利用荧光定量PCR及免疫印迹法分别从基因及蛋白水平上证实了转染载体pcDNA3.1(+)-MafA ORF+ngn33'UTR+pdx-13'UTR后的肝细胞更具有胰岛细胞特性。4.在酶联免疫法检测胰岛素合成及分泌能力中,多顺反子转染组的胰岛素合成和分泌能力高于对照组。[结论]1.以pcDNA3.1(+)为骨架,可成功构建携带Pdx-1,Ngn3,MafA的质粒载体pcDNA3.1(+)-MafA ORF+ngn33'UTR+pdx-13'UTR及其余5个用于对照实验的载体。2.通过非病毒法转染过表达载体pcDNA3.1(+)-MafA ORF+ngn33' UTR+pdx-13'UTR能更有效地诱导原代肝细胞转分化为胰岛素分泌细胞。(本文来源于《南方医科大学》期刊2013-05-10）
曲鑫建[9]（2013）在《多顺反子质粒载体重编程脂肪间充质干细胞为诱导多能干细胞》一文中研究指出诱导多能干细胞(induced pluripotent stem cells, iPSCs)是通过向分化的体细胞转入特定的外源转录因子进行重编程,从而获得具有自我更新能力和多能性的细胞。iPSCs具有形成体内所有细胞类型的潜能,尤其是能以患者自身体细胞制备iPSCs可用于特定疾病的治疗,不但能解决干细胞临床应用所遇到的免疫排斥问题和伦理医学等难题,而且在基础研究、再生医学以及药理科学中也有着广阔的发展前景和重要的意义。目前,iPSCs的来源主要是将细胞导入外源基因进行重编程而获得。但是根据细胞种类的不同,所采用的具体基因组合和转基因方式各不相同,获得的iPSCs的质量也不尽相同,存在着安全性等方面的隐患。为提高产生iPSCs的安全性,本研究采用多顺反子质粒载体在无饲养层细胞条件下重编程脂肪间充质干细胞(adipose-derived mesenchymal stem cells, ADSCs)获得iPSCs,旨在为再生医学的深入研究和应用提供更安全便利的细胞源。首先,构建了两种多顺反子质粒载体pIRES2-OSKM-EGFP和pIRES2-OS-EGFP。以分别实现四因子和两因子多顺反子质粒载体转染人ADSCs的目标。先以重迭PCR方法将酶切位点(EcoR I、SaL l和BamH I)与具有自我剪切功能的2A元件(P2A、T2A和E2A)序列插入至Oct4、Sox2、Klf4和c-Myc基因序列之间；再将各个基因片段连接(Oct4-P2A-Sox2-T2A-Klf4-E2A-c-Myc, OSKM)构建成单个开放阅读框(open reading frame, ORF);最后以双酶切、连接的方式插入pIRES2-EGFP质粒载体,构建成携带四因子的多顺反子质粒载体pIRES2-OSKM-EGFP.随后以Nhe I酶切pIRES2-OSKM-EGFP作为模板,利用PCR方法克隆Oct4-P2A-Sox2片段,再以重迭PCR方法在Oct4-P2A-Sox2序列两端添加酶切位点Nhe I和Sac I,然后以双酶切、连接的方式插入pIRES2-EGFP质粒载体,构建成携带Oct4和Sox2两个基因的多顺反子质粒载体pIRES2-OS-EGFP。经过设计特异引物进行PCR反应和测序鉴定,证实所构建的两种多顺反子质粒载体序列正确。因此,本实验成功采用2A元件构建了两种质粒载体pIRES2-OSKM-EGFP和pIRES2-OS-EGFP。然后,先使用构建的四因子多顺反子质粒pIRES2-OSKM-EGFP载体转染人ADSCs,在无饲养层细胞条件下将其重编程为iPSCs。首先分离培养ADSCs,将传代培养至第四代的ADSCs用pIRES2-OSKM-EGFP质粒载体转染一次,间隔4天后进行第二次转染。光学显微镜下观察,在转染后的3～4周,当有明显的细胞克隆出现时,将集落边缘界限清晰的细胞克隆进行挑取,并分离传代培养与鉴定。对重编程细胞的相关检测结果表明：细胞克隆的碱性磷酸酶(alkaline phosphatase, AP)表现为阳性；定量RT-PCR检测内源性多潜能相关基因Oct4、Sox2、 Klf、 c-Myc和TERT的mRNA呈高水平表达；免疫荧光细胞化学显示其表达多能性标志蛋白分子Oct4、 Nanog、TRA-1-60和SSEA4;细胞保持正常核型。更重要的是,Southern blot检测结果表明,无质粒载体序列插入／整合到iPSC基因组中。此外,体外分化实验证实可形成拟胚体(embryonic bodys, EBs)并具有分化成叁胚层细胞类型的能力；体内分化实验则表明,该细胞可形成畸胎瘤并具有分化形成叁个胚层组织的能力。因此,本实验成功使用多顺反子质粒载体转染了ADSCs,并将其重编程为iPSCs;经过细胞特异性标记基因检测和分化能力检测,证实iPSCs具有类似胚胎干细胞(embryonic stem cells, ESCs)的形态与功能。接着,使用仅携带两个多能性因子Oct4和Sox2的多顺反子质粒pIRES2-OS-EGFP载体转染ADSCs并将其重编程为具备多能性细胞特点与功能的iPSCs.先以pIRES2-OS-GFP质粒载体第一次转染ADSCs细胞,以转染当天计为向iPSCs诱导的第0天,在第7天后进行第二次转染。在含有4ng/ml碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor, bFGF)的干细胞培养液中培养传代,21天后逐步分离出集落边缘界限清晰的细胞克隆。高倍镜下集落中的单个细胞核较大,核质比例较高；细胞集落生长稳定,核型正常；AP检测其为阳性；免疫细胞化学检测细胞表达Oct4、Nanog、 TRA-1-60和SSEA4; RT-PCR检测其表达ESCs的标志基因。经体内体外分化实验,可分别检测到形成叁个胚层的EBs和畸胎瘤,并且无质粒载体序列插入／整合至iPSCs基因组中。上述实验结果显示,只采用多顺反子质粒载体携带Oct4和Sox2两个转录因子转染ADSCs,仍然可以使其重编程为iPSCs。最后,使用多顺反子质粒pIRES2-OSKM-EGFP载体重编程ADSCs获得多能性后,又进行了该细胞向神经细胞诱导分化的研究。先使用质粒载体对传代至第六代的ADSCs转染操作,以转染操作当天计为第0天。为达到更高转染效率,细胞培养4天后进行第二次转染。在第一次转染后的第7天,将原来的ADSCs生长培养基更换为添加G418药物的筛选培养基；一周后,更换为不含有G418药物的培养基。细胞进行药物筛选后继续培养。相关结果表明：经免疫荧光细胞化学检测,重编程细胞表达多能性蛋白标记Oct4、 Nanog、TRA-1-60、TRA-1-81和SSEA4; RT-PCR结果显示,细胞不仅表达多能性相关基因Oct4、Sox2、Klf4和c-Myc,还表达ESCs多能性特异基因REX1和TERT;细胞核型正常,无质粒载体序列插入／整合到iPSCs基因组中。而且,将重编程的多能细胞培养在神经诱导分化培养基中,并经过3周的诱导培养后,细胞表达神经细胞相关蛋白标志分子Nestin、GFAP、TUJl、RIP和Nurrl。进而通过免疫细胞化学技术,在培养板中随机选取不同视野,计算了表达不同蛋白标志分子阳性细胞与总细胞数目比例,结果显示：GFAP70.5±8.0%(n=258)、 TUJ182.7±7.3%(n=266)、RIP60.4±5.2%(n=212)和Nurr173.6±9.2%(n=244).因此,本试验经过细胞形态和标志分子表达检测,成功诱导了ADSCs来源的多能细胞,并使其向神经细胞发生了分化。本研究分别构建多顺反子质粒载体pIRES2-OSKM-EGFP和pIRES2-OS-EGFP,在无饲养层细胞条件下分别重编程ADSCs获得iPSCs,提高了所产生的iPSCs的安全性。(本文来源于《大连理工大学》期刊2013-04-15）
武玉永,姚庆收,马立新[10]（2013）在《油菜叶绿体多顺反子双交换表达载体的构建(英文)》一文中研究指出[目的]构建甘蓝型油菜叶绿体多顺反子表达载体,以期为油菜叶绿体基因工程研究奠定基础。[方法]根据GenBank中已知的油菜叶绿体DNA序列AF267640和Z50868,设计两对引物,用PCR方法获得了两段甘蓝型油菜叶绿体DNA片段,分别命名为RbcL和ACCD。将这两段甘蓝型油菜叶绿体DNA同源片段克隆到质粒pMD18-T中得到质粒pHBM715,然后再将由壮观霉素抗性基因aadA、甘露聚糖酶基因man和绿色荧光蛋白基因gfp这3个基因串联的表达盒克隆到质粒pHBM715中,从而构建成甘蓝型油菜叶绿体多顺反子表达载体pHBM716,并将该载体在大肠杆菌中进行表达鉴定。[结果]通过平板定性分析对所构建的油菜叶绿体表达载体上的表达盒进行了功能鉴定,表明同一多顺反子的3个基因在大肠杆菌中均得到了表达。[结论]该研究成功构建了甘蓝型油菜叶绿体多顺反子表达载体,为油菜叶绿体基因工程研究奠定了基础。(本文来源于《Agricultural Science & Technology》期刊2013年03期）
多顺反子论文开题报告
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
为了研究禽类多瘤病毒(Avian polyomavirus,APV)晚期基因多顺反子翻译起始调控机制,Agno-1a前导蛋白对下游VPs蛋白合成的调控机制的影响作用。设计构建一系列新型cDNA重组病毒,在agno-1a mRNA编码序列的ATG区域,设计插入一个和插入两个含有ATG的最佳翻译起始信号的7个氨基酸in-frame片段。在agno-1a编码mRNA序列的ATG区域,设计PCR点突变,使起始密码子ATG变成ACG或CTG,从而关闭agno-1a的翻译并可能改变关键mRNA二级结构,形成ATG突变型重组克隆。片段插入型克隆:SDS碱裂解法,提取APV cDNA克隆pHL1003质粒DNA,用限制性内切酶Acc I部分酶切,得到回收的载体片段,人工合成的27bp DNA并磷酸化的目的片段,经T4连接酶与载体片段连接,筛选阳性重组质粒,通过测序验证,得到片段插入型cDNA克隆pHL1003+1、pHL1003+2。点突变型克隆:用限制性内切酶Nco I完全酶切和Acc I部分酶切pHL1003质粒DNA,得到载体片段,设计PCR点突变起始密码子ATG变为ACG和CTG的目的片段,与载体片段连接,筛选阳性克隆测序验证。设计构建GFP为下游报告基因荧光标记的APV-1晚期基因真核双顺反子表达载体,以EGFP报告基因替代野生型病毒APV-1编码晚期结构蛋白VPs基因的碱基序列。pHL1003质粒DNA为模板,PCR扩增出与野生型病毒APV-1相同的Ori区、早期编码区和晚期agno-1a区序列,作为载体片段,载体片段黏性末端补齐平末端连接后,得到重组质粒pHL1003-1(可作为Agno-1a蛋白表达质粒)。质粒DNA pEGFP-N1为模板,PCR扩增出编码绿色荧光蛋白的EGFP片段,作为目的片段与上述载体片段经T4连接酶连接,构成重组质粒pHL1003-GFP,测序验证。用限制性内切酶NruI和NedI双酶切pHL1003+1、pHL1003+2和pHL1003-GFP,得到目的片段和载体片段连接,构建pHL1003+1-GFP,pHL1003+2-GFP克隆。通过磷酸钙和脂质体的转染方法,将构建成功的cDNA突变型质粒DNA,分别定量转染到鸡胚和鹌鹑胚胎成纤维细胞中,分别利用Western blot和荧光显微镜观察检验。Western blot结果显示出部分特异性条带,荧光显微镜观察转染72 h后的鸡胚和鹌鹑胚胎成纤维细胞,转染成功胚胎细胞明显表达较强的荧光。结果表明,GFP荧光标记的APV-1真核双顺反子cDNA表达载体在鸡胚和鹌鹑胚胎成纤维细胞中正常表达了GFP蛋白并产生荧光。转染实验过程中,对转染过程的时间,转染质粒DNA的用量和转染过程中培养基pH等方面条件不断优化,提高了转染效率。根据不同质粒DNA组合转染不同染禽类胚胎原代细胞及其荧光表达量的差异的结果分析提示,在APV晚期基因多顺反子上游基因插入额外起始密码ATG会影响下游顺反子的翻译;Agno-1a蛋白对其下游基因翻译起始起重要的正调控作用。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
多顺反子论文参考文献
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