沙冬青三个抗逆相关NAC转录因子基因的克隆与功能研究

论文摘要

NAC（NAM、ATAF和CUC）蛋白是植物特有的一类转录因子,在植物生长发育和抵御逆境胁迫中起重要作用。沙冬青是我国西北荒漠地区唯一的常绿阔叶植物,在研究植物抗逆机理和挖掘抗逆基因中具有独特用途。实验室在前期研究中从沙冬青转录组中筛选到8个受干旱和低温诱导的NAC转录因子基因。本研究对其中3个基因,即AmNAC3、AmNAC4和AmNAC5进行了克隆,并对其编码蛋白的结构特征、亚细胞定位和转录激活活性等进行了分析,同时对其在响应和抵抗多种非生物胁迫中的作用进行了研究。主要结果如下:（1）利用PCR方法扩增到AmN4C3、AmNAC3、和AmN4C5的编码区cDNA和gDNA片段。其编码区cDNA长度分别为846、879和891bp,推测蛋白产物分别由281、292和296个氨基酸残基组成;对应的编码区gDNA长度分别为1213、1231和1729 bp,其中均含有3个外显子和2个内含子。（2）经过多序列比对和保守域分析,发现在AmNAC3、AmNAC4和AmNAC5蛋白序列的N端均含有一个典型的NAC结构域,其中又包含A～E 5个亚结构域,且在C、D亚结构域中均含有一个核定位信号。利用GFP融合蛋白和酵母自激活体系,检测到3种AmNAC蛋白均定位于细胞核内、均具有转录激活活性,并且其转录激活区域均位于蛋白的C端。（3）利用RT-qPCR技术分析了 3个基因的表达模式。在室内人工培养的沙冬青幼苗地上部和/或根中,3个基因的转录水平均受干旱、盐、低温和高温胁迫及外源ABA的诱导而上调,但总体上AmN C3受干旱.和盐胁迫及ABA诱导较为迅速而且明显,AmNAC4受四种胁迫诱导较快或幅度较大,而AmNAC5主要受干旱、盐和高温胁迫及ABA诱导。在野外自然生长植株的嫩叶中,AmNAC3和AmNAC5在11和12月份表达量为全年最高,而在其他月份表达量较低;AmNAC4在1、11和12月表达量远高于其他月份。在春季野外生长植株中,AmNAC3在侧根和嫩枝中高表达,在嫩叶、花蕾和未成熟果荚中低表达;AmNAC4在嫩叶中表达量明显高于其他器官;AmN4C5主要在侧根和嫩叶中表达。（4）将3个基因分别在拟南芥中进行组成型表达,根据转基因株系在不同非生物胁迫和外源ABA处理下的表型和生理指标变化,对其抗逆功能进行评价。AmNAC3可提高耐盐性,降低耐热性和叶片保水性;AmNAC4可提高抗旱性、耐盐性和抗冻性;AmNAC5可以提高抗旱性和耐盐性,降低对外源ABA的敏感性。三个基因还可以提高转基因株系在胁迫处理下对氧化胁迫的抗性和细胞膜及叶绿素的稳定性。（5）3个基因可以诱导其转基因株系中多个胁迫相关基因的转录水平上调。AmNAC3可诱导RD29A、RD29B、POD和NHX1表达量上调;AmNAC4可诱导RD29A、RD29B、POD、ALDH7B4、P5CS1 COR15a表达量上调,而 AmNAC5的上调基因包括 RD29B、POD、CAT、ALDH7B4 和 RD29A。（6）在AmNAC4的启动子中含有响应低温、干旱、光和ABA等因素的顺式作用元件,此外还有MYB转录因子的结合位点。在转基因拟南芥中,该启动子主要在幼苗的地上部分和成株的花中起作用,此外其在幼苗中的启动活性主要受低温、高盐和热胁迫所诱导。上述研究结果为进一步研究和利用3个AmNA基因的抗逆功能和解析沙冬青的抗逆机理提供了重要依据。

论文目录

• 摘要
• abstract
• 缩略词表
• 1 引言
•   1.1 植物在非生物胁迫下的信号转导途径
•     1.1.1 植物响应干旱胁迫的信号转导途径
•     1.1.2 植物响应盐胁迫的信号转导途径
•     1.1.3 植物响应低温胁迫的信号转导途径
•     1.1.4 植物响应高温胁迫的信号转导途径
•   1.2 植物NAC转录因子
•     1.2.1 NAC转录因子的结构特征
•     1.2.2 NAC转录因子的分类
•     1.2.3 NAC转录因子的功能
•   1.3 沙冬青抗逆性研究进展
•     1.3.1 蒙古沙冬青抗逆性研究进展
•     1.3.2 新疆沙冬青抗逆性研究进展
•   1.4 本研究的目的与意义
•   1.5 本研究的技术路线
• 2 材料与方法
•   2.1 实验材料
•     2.1.1 植物材料
•     2.1.2 野外取样
•     2.1.3 菌株和载体
•     2.1.4 实验试剂及酶
•     2.1.5 所有引物序列
•   2.2 实验方法
•     2.2.1 溶液及试剂的配制
•     2.2.2 常用培养基配制
•     2.2.3 沙冬青幼苗胁迫处理
•     2.2.4 RNA提取及反转录
•     2.2.5 DNA提取
•     2.2.6 实时荧光定量PCR（RT-qPCR）
•     2.2.7 cDNA末端快速扩增（RACE）
•     2.2.8 基因全长克隆与测序
•     2.2.9 蛋白基本特征分析
•     2.2.10 蛋白亚细胞定位分析
•     2.2.11 转录激活活性分析
•     2.2.12 转基因拟南芥抗逆性鉴定
•     2.2.13 转基因株系中胁迫相关基因表达分析
•     2.2.14 启动子克隆与GUS组织化学染色
•     2.2.15 数据分析
• 3 结果与分析
•   3.1 三个AmNAC基因的克隆及内含子分析
•     3.1.1 三个AmNAC基因cDNA编码区的克隆
•     3.1.2 三个AmNAC基因gDNA编码区的克隆与内含子分析
•   3.2 三个AmNAC基因编码蛋白生物信息学分析
•     3.2.1 三种AmNAC蛋白基本特征特性分析
•     3.2.2 三个AmNAC基因编码蛋白进化分析
•   3.3 三个AmNAC基因编码蛋白亚细胞定位分析
•     3.3.1 AmNAC3/4/5-GFP融合蛋白表达载体构建
•     3.3.2 AmNAC3/4/5-GFP融合蛋白亚细胞定位观察
•   3.4 三个AmNAC基因编码蛋白转录激活活性分析
•     3.4.1 三个AmNAC基因酵母表达载体的构建
•     3.4.2 不同AmNAC蛋白转录激活活性分析
•   3.5 三个AmNAC基因的表达模式分析
•     3.5.1 用于RT-qPCR引物质量的评估
•     3.5.2 室内培养幼苗中AmNAC3/4/5在不同胁迫下的表达分析
•     3.5.3 室内培养幼苗中三个AmNAC基因在ABA处理下的表达分析
•     3.5.4 野外生长植株嫩叶中三个AmN4C基因在不同月份的表达分析
•     3.5.5 野外生长植株不同器官中三个AmNAC基因的表达分析
•   3.6 三个AmNAC基因转基因拟南芥的获得与分子检测
•     3.6.1 植物表达载体的构建与转化农杆菌
•     3.6.2 转基因拟南芥的PPT筛选与PCR检测
•     3.6.3 转基因拟南芥的半定量RT-PCR检测
•   3.7 三个AmNAC转基因拟南芥抗逆性鉴定与相关基因表达分析
•     3.7.1 AmVAC3转基因拟南芥抗逆性鉴定与相关基因表达分析
•     3.7.2 AmNAC4转基因拟南芥抗逆性鉴定与相关基因表达分析
•     3.7.3 AmNAC5转基因拟南芥抗逆性鉴定与抗逆相关基因表达分析
•   3.8 AmNAC4启动子的克隆与分析
•     3.8.1 启动子的克隆及其顺式作用元件分析
•     3.8.2 启动子驱动GUS报告基因表达载体构建
• AmNAC4:S组织化学染色'>    3.8.3 Pro_AmNAC4:S组织化学染色
• 4 讨论
•   4.1 AmNAC3/4/5是沙冬青NAC基因家族的重要成员
•   4.2 AmNAC3可能对耐盐性和耐热性分别起正、负调节作用
•   4.3 AmNAC4可能是提高抗旱性、耐盐性和抗冻性的重要正调节因子
•   4.4 AmNAC5可能通过依赖ABA的信号途径对抗旱性和耐盐性起正调节作用
•   4.5 AmNAC3/4/5通过调节抗逆相关基因的表达而起作用
• 5 结论
• 6 展望
• 致谢
• 参考文献
• 作者简介

文章来源

类型: 博士论文

作者: 任美艳

导师: 王茅雁

关键词: 沙冬青,转录因子,基因克隆,表达分析,抗逆功能

来源: 内蒙古农业大学

年度: 2019

分类: 基础科学

专业: 生物学,生物学

单位: 内蒙古农业大学

基金: 国家自然科学基金

分类号: Q943.2

总页数: 111

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