黑曲霉内切葡聚糖酶AnCel5A的表达纯化与晶体优化

论文摘要

来源于黑曲霉（Aspergillus niger）的β-1,4-内切葡聚糖酶（AnCel5A）是糖苷水解酶第5家族成员,水解纤维素分子无定形区的β-1,4-糖苷键,在纤维素的降解过程中发挥关键作用。本研究通过对AnCel5A的结晶条件初筛,获得并优化AnCel5A晶体以期解析其蛋白质晶体结构。将截去N端信号肽的AnCel5A蛋白在Pichia pastoris X33/pPICZαA中进行表达,发酵液上清透析除盐并进行Endo H去糖基化酶切,后续依次通过离子交换层析、疏水层析,获得高纯度蛋白。通过坐滴气相扩散法对AnCel5A的结晶条件进行初筛,在CryoI screen kit （A6）孔中长出了初始晶体,经优化获得了更好的晶体。蛋白晶体于台湾新竹同步辐射中心（NSRRC）BL15A1线站进行了X射线衍射数据收集,结果显示其分辨率达到1.8?。

论文目录

• 1 材料与方法
•   1.1 材料
•     1.1.1 试剂
•     1.1.2 仪器
•     1.1.3 菌种
•   1.2 方法
•     1.2.1 重组菌株的表达
•     1.2.2 发酵液收集与纯化预处理
•     1.2.3 DEAE Sepharose 6 Fast Flow
•     1.2.4 Phenyl Sepharose 6 Fast Flow
•     1.2.5 超滤浓缩
•     1.2.6 蛋白质浓度测定
•     1.2.7 纯度分析
•     1.2.8 AnCel5A蛋白结晶条件初筛、优化及衍射数据收集
• 2 结果与讨论
•   2.1 糖基化酶切效果验证
•   2.2 DEAE Sepharose 6 Fast Flow
•   2.3 Phenyl Sepharose 6 Fast Flow
•   2.4 AnCel5A蛋白浓缩及浓度测定
•   2.5 AnCel5A结晶蛋白初筛结果观察
•   2.6 结晶条件优化及衍射数据收集
•     2.6.1 结晶条件优化
•     2.6.2 衍射数据收集
• 3 结语

文章来源

类型: 期刊论文

作者: 颜俊杰,李玉洁,郑迎迎,陈纯琪,郭瑞庭,李华钟,刘卫东

关键词: 内切葡聚糖酶,纯化,结晶,结构

来源: 食品与生物技术学报 2019年02期

年度: 2019

分类: 工程科技Ⅰ辑,基础科学

专业: 生物学

单位: 江南大学教育部工业生物技术重点实验室,中国科学院天津工业生物技术研究所

基金: 国家863计划项目(2012AA022209)

分类号: Q936

页码: 81-86

总页数: 6

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