导读:本文包含了宇佐美曲霉论文开题报告文献综述及选题提纲参考文献，主要关键词:环氧化物水解酶,克隆表达,对映选择性,半理性设计
宇佐美曲霉论文文献综述
胡蝶[1]（2017）在《宇佐美曲霉环氧化物水解酶的基因克隆、分子改造及在手性化合物合成中的应用》一文中研究指出手性环氧化物和邻二醇是一类高附加值的多功能合成子,广泛应用于医药、农药和精细化工品的合成。环氧化物水解酶(epoxide hydrolases,EHs)能特异性水解外消旋或内消旋环氧化物制备手性环氧化物和邻二醇。但对映选择性偏低、产物抑制和稳定性低等缺陷限制了EHs的工业化应用。挖掘新型EHs或对现有EHs进行分子改造是突破该酶产业发展瓶颈的关键。本论文以宇佐美曲霉Aspergillus usamii E001作为出发菌株,克隆并表达了一种环氧化物水解酶AuEH2,构建并优化了双相催化体系下该酶的水解工艺,应用半理性设计策略改造了AuEH2的对映选择性,获得优良突变酶并应用于手性环氧化物和邻二醇的制备。本研究将促进AuEH2及其突变体的产业化生产和应用,并为其它酶的分子改造提供新思路。(1)采用RT-PCR和THSO-PCR技术,从A.usamii中克隆一种新型Aueh2基因,其开放阅读框为1188 bp,共编码395个氨基酸。生物信息学分析表明AuEH2与已报道EHs的最高同源性为58.2%,其包含α/β水解酶超家族特有的HGXP、S_mXNuXS_mS_m和GGHFAALE保守区域,推测其催化叁联体为D~(191)-H~(369)-E~(343)和保守质子供体为Y~(249)和Y~(312);AuEH2叁维结构由N末端卷曲结构域(M~1~P~(84))、核心结构域(Q~(85)~L~(212)和P~(317)~K~(395))和“帽子”结构域(S~(247)~F~(316))叁部分组成,属于微粒体EH亚家族。(2)借助pET28a(+)质粒实现Aueh2基因在大肠杆菌BL21(DE3)中高效异源表达。以环氧苯乙烷1a为底物,最佳诱导条件下的比活力最高达1440 U·L~(-1)(35℃),重组菌E.coli/Aueh2的比活力为533 U·g~(-1) cdw(25℃)为野生菌A.usamii E001的400倍,可溶性AuEH2占重组菌总蛋白的35.7%。SDS-PAGE分析其表观分子量为44.3 kDa,纯酶比活力高达9.7 U·mg~(-1),其最适pH和温度分别为7.0和35℃,在pH 6.5~7.5和25~40℃条件下具有较高催化活性和稳定性。针对(R)-1a和(S)-1a,AuEH2的专一性常数比值(k~R_(cat)/K_m~R)/(k~S_(cat)/K_m~S)为8.9,表明其优先水解(R)-1a,区域选择性系数β_R和β_S分别为98.3%和98.8%,表明其专一性攻击C_β。分子对接模拟结果表明(R)-1a的氧原子更易与Y~(312)形成氢键而质子化,且C_β更易被D~(191)亲核攻击,从而被优先水解。(3)不同温度条件下,重组菌E.coli/Aueh2水解动力学拆分rac-1a制备(S)-1a的ee_s>99%,产率为38%(10℃)、32%(20℃)和27.5%(35℃),E值为24.2(10℃)、19.3(20℃)和10.3(35℃),表明酶促反应温度是影响该酶对映选择性的关键因素之一。底物谱分析表明E.coli/Aueh2水解单取代环氧化物1a~17a的比活力为119~1143 U·g~(-1) cdw,E值为2.1~95.9;水解芳香族环氧乙烷保留(S)-1a~6a生成邻二醇(R)-1b~6b,水解缩水甘油醚衍生物保留(R)-8a~14a生成邻二醇(S)-8b~14b,水解脂肪族环氧乙烷保留(S)-15a生成邻二醇(R)-15b,对内消旋环氧化物18a无活性,表明reAuEH2具有广阔的底物谱。(4)在单水相体系中,AuEH2水解1a具有高底物浓度耐受性(>1 M),但存在产物抑制作用(<300 mM)。正己醇/缓冲液双相催化体的最佳工艺条件为:相体积比为1:1(v/v),S/E比值为6(w/w)和反应温度25℃。在此条件下,实现了高浓度环氧苯乙烷的水解动力学拆分。与单水相体系相比,底物浓度从24 g·L~(-1)(200 mM)提高至120 g·L~(-1)(1M),提高5倍,时空产率从3.15 g·L~(-1)·h~(-1)提高至20.3 g·L~(-1)·h~(-1),提高6.4倍;(S)-1a的ee_s值从36.8%提高至98.2%。研究表明该双相催化体系能有效解除产物抑制,从而显着提高的底物浓度和生产效率。(5)基于计算机辅助设计选定底物结合口袋中的8个关键氨基酸(K~(195)、A~(214)、Y~(216)、S~(247)、A~(250)、N~(315)、L~(344)和V~(345))进行定点和迭代饱和突变,构建约750个转化子的“smart”突变体文库。以1a为模式底物,高通量筛选获得11个对映选择性提高的突变体,E值从16.2提高至18.7~202.2(25℃),提高1.2~12.3倍。其中,AuEH2~(A250I)和AuEH2~(A250I/A214C)催化rac-1a的E值分别为48.2和202.2,比活力分别为10.7和16.7 U·mg~(-1)(25℃)。与AuEH2相比,AuEH2~(A250I)和AuEH2~(A250I/A214C)动力学拆分rac-1a制备(S)-1a的产率分别从39.8%提高至43.8%和49.1%(理论产率为50%),产物(R)-苯基乙二醇的ee_p分别从65.8%提高至78.5和95.5%。动力学常数结果表明,突变体AuEH2~(A250I)和AuEH2~(A250I/A214C)对映选择性的提高主要是通过显着提高(R)-1a的k_(cat)值和(S)-1a的K_m来实现。(6)底物谱分析表明,突变体水解环氧化物1a~15a的比活力从119~1143 U·g~(-1) cdw提高至189~1400 U·g~(-1) cdw,E值从2.1~95.9提高至16.2~341.7(25℃),为原酶的2.1~18倍。针对1a、3a~6a、8a、11a~13a和15a的10种环氧化物的E值均>30,其中突变体对1a(E>200)、3a(E=39.9)、4a(E>200)、6a(E=37.4)、10a(E=18.3)和12a(E=35.7)为目前报道最高。利用优良突变体水解动力学拆分rac-1a~15a制备手性环氧化物的ee_s和产率为97.1~99.9%和36.3~49.1%,以及手性邻二醇ee_p为56.7~95.5%,具备工业化应用的潜力。(本文来源于《江南大学》期刊2017-06-01）
朱天地[2]（2015）在《宇佐美曲霉乙酰木聚糖酯酶的基因克隆、表达及酶学性质研究》一文中研究指出乙酰木聚糖酯酶(EC 3.1.1.72)于上世纪90年代被发现,是木聚糖降解酶系的关键酶之一,其在乙酰化木聚糖降解过程中的主要作用是消除D-木糖残基C2和C3位上的O-乙酰取代基团。天然微生物的乙酰木聚糖酯酶存在表达量低、酶活性低以及产物不纯等缺点,其应用受到局限。本论文将来自宇佐美曲霉(Aspergillus usamii)E001的乙酰木聚糖酯酶基因在毕赤酵母(Pichia pastoris)GS115中实现异源表达,并对其相关酶学性质进行了研究。以宇佐美曲霉(A.usamii)E001总RNA为模板,利用软件Oligo 7.0设计引物Auaxe-F和Auaxe-R,进行RT-PCR扩增出编码乙酰木聚糖酯酶的c DNA基因(Auaxe),构建重组克隆载体p UCm-T-Auaxe进行保种测序,结果显示该基因序列长828 bp,编码275个氨基酸。将Auaxe序列与表达载体p PIC9KM连接,构建重组表达质粒p PIC9KM-Auaxe,Sal I线性化后电击转入毕赤酵母基因组中,遗传霉素(G418)筛选获得阳性转化重组酵母GS115/Auaxe,经1%甲醇诱导表达72 h,以对硝基苯酚醋酸酯为底物,50℃、p H 6.0条件下通过分光光度法测得重组乙酰木聚糖酯酶(re Au Axe)的酶活性为35.6 U/m L。此外,为了提高乙酰木聚糖酯酶蛋白的表达量,对GS115/Auaxe的诱导表达条件进行了优化,re Au Axe的酶性活最高达到98.5 U/m L,是优化前的2.11倍。采用(NH4)2SO4沉淀、DEAE-52阴离子交换层析和透析的方法对重组乙酰木聚糖酯酶粗酶液进行分离纯化。结果表明,其纯化倍数为1.7,回收率为63.1%,SDS-PAGE电泳结果显示纯化后的乙酰木聚糖酯酶在34.0 k Da处有一条清晰条带,测其比酶活为390.5 U/mg。该酶最适作用p H为6.0,在p H 4.5~7.0之间性质较稳定;最适作用温度为50℃,在45℃及以下性质稳定;所测金属离子及EDTA对该酶活性影响不明显;以对硝基苯酚醋酸酯为底物,在50℃、p H 6.0的条件下,该酶的Km和Vmax值分别为0.72mmol/L和555.6 U/mg。以小麦麸皮为研究对象,探究重组乙酰木聚糖酯酶分别与重组木聚糖酶(re Au Xyn11A和re Au Xyn10A)、重组纤维素酶(re Au Cel12A)及复合酶之间的协同作用。结果表明,当re Au Axe与re Au Xyn11A的酶量比为5:1时协同效果较好,还原糖生成量比re Au Xyn11A单独作用增加了46%;当re Au Axe与re Au Xyn10A的酶量比为5:1时协同效果较好,还原糖生成量增加了16%;同样re Au Axe与re Au Cel12A以5:1添加时,还原糖生成量比re Au Cel12A单独作用增加了28.4%;re Au Axe与复合酶以5:1添加时,还原糖生成量提高了33.6%。(本文来源于《江南大学》期刊2015-06-01）
汪俊卿[3]（2014）在《宇佐美曲霉木聚糖酶AusXyn10A的克隆表达及耐热性的改造研究》一文中研究指出随着人们对自然界中生物质资源和农业副产品开发利用的重视和低聚木糖生理功能研究的深入，作为生物质资源降解酶系主要成员的木聚糖酶也成为近几年研究的热点。β-1,4-内切木聚糖酶(EC3.2.1.8)能够作用于木聚糖主链内部，通过随机切割的方式将木聚糖降解为低聚木糖和少量木糖。作为一种绿色高效的生物催化剂，木聚糖酶已被广泛应用在饲料、造纸、医药、能源及食品等工业领域中。虽然目前国内外已有大量木聚糖酶已被克隆和表达，但多数酶常常难以满足工业应用中经常遇到或需要的高温环境，因而限制了该酶的应用范围。论文克隆了宇佐美曲霉(Aspergillus usamii) E001GH10家族木聚糖酶AusXyn10A的完整cDNA和DNA序列，将该酶成熟肽的编码基因实现了在毕赤酵母(Pichia pastoris)GS115和大肠杆菌(Escherichia coli) BL21中的异源表达，并在此基础上利用计算机辅助设计通过N/C端片段替换、二硫键添加以及点突变对该酶的热稳定性进行了理性/半理性改造研究，主要研究结果如下：(1)构建了一种发卡结构介导的PCR (HSO-PCR)技术，结合3′-RACE和5′-RACE方法获得了AusXyn10A基因完整的cDNA和DNA序列；cDNA序列长度为1,235bp，包括80bp的5′-端非翻译区、984bp的开放读码框和171bp的3′-端非翻译区，可编码327个氨基酸；其DNA长度为2,255bp，包含9个长度为52-62bp的内含子；生物信息学分析的结果表明AusXyn10A包括19个氨基酸残基的信号肽、6个氨基酸残基的前导肽和302个氨基酸残基的成熟肽。(2)构建了一种蛋白天然N端表达质粒pPIC9KM，并应用该质粒将AusXyn10A成熟肽的编码基因整合到P. pastoris GS115基因组中，获得的高拷贝重组子GSX10A4-14产酶活性高达100.8U mL-1；经优化后GSX10A4-14在接种量8%、初始pH值7.0、甲醇诱导量2.5%、温度30℃及诱导时间120h的表达条件下产酶水平可达368.6U mL-1，是优化前酶活性的3.25倍；结果表明，reAusXyn10A的最适反应pH和温度分别为5.5和50℃、在45℃以下及pH值4.5~8.5之间具有较好的稳定性；除Mn2+离子外，其它所测的金属离子及EDTA对该酶的酶活性没有明显的影响；以桦木木聚糖为底物，reAusXyn10A的Km和Kcat值分别为2.25mg mL-1和3,419.4s-1；以玉米芯木聚糖为底物，优化后的水解条件为：底物浓度50g L-1，酶添加量300U g-1，反应时间10.0h后体系中的还原糖量可达15.45g L-1，TLC分析显示其水解产物以木叁糖为主，表明该酶具有制备低聚木糖的应用潜力。(3)根据海栖热袍菌(Thermotoga maritima) MSB8中的嗜热木聚糖酶TmxB和AusXyn10A的序列比对结果，将AusXyn10A C端的A300NA302替换为TmxB中的KEVLEKKIEER，利用大引物PCR技术构建出AusxynCRC1并在P. pastoris中表达；结果表明，reAusXynCRC1的最适温度为50℃，与原酶reAusXyn10A一致，但该酶在50℃下的半衰期仅为5min，较原酶的40min有明显的降低；根据叁维结构比对结果，在AusXynCRC1的基础上引入突变H13L和A12K，构建AusXynCRC2并在P. pastoris中表达；结果表明，突变酶reAusXynCRC2在50℃的半衰期由reAusXynCRC1的5min提高到8min，在50℃下保温10min后残余相对酶活由0%提高到40%；此外，reAusXynCRC2的比酶活较原酶提高38%。(4)根据分子动力学模拟和B因子(B-factor)值计算，确定用嗜热子囊菌(Thermoascus aurantiacus)中嗜热木聚糖酶TaXyn10N端区域的氨基酸片段YTLTKDSKTP替换AusXyn10A相对应的片段N24RLTTGKNA32，构建N端片段替换酶AusXynCRN1基因并在P. pastoris中表达；结果表明reAusXynCRN1的最适温度与原酶reAusXyn10A一致，在55℃下半衰期由6.9min提高到了8.0min；根据叁维结构比对分析结果，在AusXynCRN1中同时引入突变S286G和H288F，构建突变酶AusXynCRN2并在P. pastoris中表达；结果表明，reAusXynCRN2的最适温度为60℃，较原酶提高了10℃，在55℃的半衰期由6.9min提高到了72min，是原酶的10.4倍，此外reAusXynCRN2的比酶活为8,129U mg-1，较原酶reAusXyn10A提高49%，该结果也表明基于分子动力学模拟的热稳定性预测具有一定的可行性。(5)根据Disulfide by Design V1.20软件和分子动力学模拟预测结果，筛选出RMSD值低于原酶AusXyn10A的二硫键突变酶D7C/G42C和S246C/A297C并分别在P. pastoris中表达；结果表明，reS246C/A297C的最适温度为55℃，较原酶提高了5℃，且在50℃保温60min残余酶活大于80%，较原酶（残余酶活39%）有明显提高，表明246-297位二硫键的添加能够大幅提高酶的热稳定性；reD7C/G42C的最适温度和热稳定性较原酶则有一定程度的下降。(6)通过表达质粒pET-28a实现AusXyn10A在E. coli BL21中的表达，并使用PCR仪和酶标仪对其酶学性质进行分析，结果表明，经E. coli BL21表达的AusXyn10A的最适反应温度为44℃，最适pH值为5.5，在pH6.6~7.8的范围内稳定，为后续的高通量筛选打下基础；根据B-factor值计算结合多序列比对分析，选择R59、S278和S280叁个位点实施饱和突变或定点突变；经转化、高通量筛选及热稳定性分析，获得S280V、S278A、N111S和R59C/A35G四株热稳定性提高突变子；它们的最适温度较原酶AusXyn10A (44℃)均提高了约2.0℃，T5020值较AusXyn10A分别提高了2.0℃、2.0℃、0.8℃和0.7℃；根据论文中所有突变子的分析结果，将N端片段替换(含突变S286G/H288F)及D7C/G42C二硫键突变进行组合，获得的突变酶reXynCRN2-S246C/A297C的t1/260值为19min，是reAusXynCRN2t1/260值的1.6倍，表明该突变酶热稳定性较reAusXynCRN2有了进一步的提升。(本文来源于《江南大学》期刊2014-06-01）
杨琥[4]（2014）在《宇佐美曲霉酸性蛋白酶在毕赤酵母中的表达及其酶学性质的研究》一文中研究指出酸性蛋白酶作为一种动物饲料添加剂,能够有效地提高动物胃部对氨基酸和小肽的吸收。目前,所有的工业级酸性蛋白酶都来源于曲霉属真菌,但其产量很低。本研究的目的就是通过甲基营养型酵母毕赤酵母得到高产量的酸性蛋白酶。本研究的主要结果如下：1.宇佐美曲霉酸性蛋白酶(PepA)的基因合成宇佐美曲霉酸性蛋白酶PepA基因由1182个碱基组成并编码394个氨基酸(其中有20个氨基酸编码信号肽序列,50个氨基酸编码前导肽,324个氨基酸编码成熟酶)。编码区在不改变氨基酸序列的前提下,根据毕赤酵母密码子的偏爱性进行优化并合成pepA。2. PepA表达载体的构建和表达PepA在毕赤酵母载体pHBM905A中成功地实现表达。重组酵母菌体命名为PEPASA,然而,其产量不高,即0.578mg/ml。于是,我们通过2种方法来提高PepA在毕赤酵母中的表达量。一种方法是构建新的毕赤酵母表达载体pHBM905BDM,它包括AOX启动子突变体和合成型信号肽(MF4I),实验数据表明与PepA在pHBM905A表达载体上产量相比,PepA在pHBM905BDM表达载体上产量仅仅提高了1%。另一种方法是运用体外构建多拷贝的方法选育出含有不同拷贝数的重组菌株。将带有1,2,3,4拷贝的酵母重组菌分别命名为PEPAS1, PEPAS2, PEPAS3, PEPAS4。结果显示随着拷贝数的增加,一拷贝菌株到叁拷贝菌株的PepA产量呈递增趋势,当增加到四拷贝时,PepA的产量开始减少。菌株PEPAS1, PEPAS2, PEPAS3, PEPAS4的PepA产量分别为0.593mg/ml,0.669mg/ml,1.058mg/ml,0.975mg/ml。其结果与通过qRT-PCR分析各拷贝菌株中pepA基因在转录水平上mRNA的丰度趋势一致。叁拷贝菌株PEPAS3在30L发酵罐中高密度发酵72小时后PepA产量达到4.3mg/ml。本研究中提高表达量的方法可以应用于其他重要的工业酶。3. PepA的纯化PepA通过硫酸铵沉淀法进行纯化,纯度提高了1.3倍,比活性为4127.3U/mg。通过SDS-PAGE电泳分析,相对于天然PepA的分子量大小44kDa,PepA在毕赤酵母中表达发生了糖基化其分子量大小为76kDa。宇佐美曲霉酸性蛋白酶PepA存在1个N糖基化的预测位点和3个0糖基化的预测位点。由于糖基化修饰提高了PepA的热稳性,从而进一步提高了其高拷贝菌株表达PepA的比活性。4.纯化后PepA的酶学性质该酶的最适PH值为2.5,最适温度为50℃。PMSF对宇佐美曲霉酸性蛋白酶的活性没有影响,所以该酶为天冬氨酸蛋白酶。Ca2+,Zn2+,Fe2+,NH4+对该酶有激活作用,而Cu2+,Co2+,Mg2+,Fe3+,SDS对该酶有抑制作用。(本文来源于《湖北大学》期刊2014-05-25）
龚燕燕,殷欣,唐存多,邬敏辰,曾妍[5]（2014）在《宇佐美曲霉阿魏酸酯酶与木聚糖酶协同作用降解小麦麸皮制备阿魏酸》一文中研究指出目的利用宇佐美曲霉(Aspergillus usamii)阿魏酸酯酶与木聚糖酶协同降解小麦麸皮,制备阿魏酸(ferulic acid,FA)。方法将工程酵母菌P.pastoris GS115/AusfaeA和GS115/Ausxyn11A经甲醇诱导发酵,分别获得重组阿魏酸酯酶和木聚糖酶。在pH 5.0、40℃、料液比1∶60(g∶ml)、水解10 h的条件下,探讨木聚糖酶添加量、阿魏酸酯酶与木聚糖酶协同作用对阿魏酸酯酶水解去淀粉麦麸(destarched wheat bran,DSWB),释放FA的影响,并检测酶解产物FA的体外抗氧化活性。结果在0.5g DSWB中单独加入56U阿魏酸酯酶时,FA的释放率为碱提等量麸皮总FA含量的19.48%;在此基础上添加木聚糖酶,能促进阿魏酸酯酶进一步释放FA,当木聚糖酶添加量为300 U时,FA的释放率从19.48%上升至70.10%;木聚糖酶单独作用于DSWB未检测到FA的释放;在反应体系中先添加木聚糖酶,能释放1.23 mg FA,比先添加阿魏酸酯酶提高了0.3 mg;随着FA浓度的增加,FA的还原能力及其对DPPH自由基和羟基自由基的清除能力均呈稳定增长,各浓度FA对羟基自由基的清除能力均高于对DPPH自由基的清除能力。结论阿魏酸酯酶与木聚糖酶之间存在协同作用,双酶共同作用,有利于小麦麸皮的降解,提高FA的释放率。(本文来源于《中国生物制品学杂志》期刊2014年02期）
胡蝶,朱利娟,邬敏辰,汪俊卿,唐存多[6]（2013）在《宇佐美曲霉环氧化物水解酶基因的克隆与生物信息学分析》一文中研究指出环氧化物水解酶(Epoxide hydrolase,EH)是酶法拆分消旋体环氧化物,制备光学活性环氧化物和邻二醇的重要酶之一。通过RT-PCR和新构建的THSO-PCR侧翼未知DNA序列扩增技术,克隆了一种来源于宇佐美曲霉(Aspergillus usamii)E001的EH基因,命名为Aueh2(GenBank No.KF061095),并对该基因进行了相关生物信息学分析。Aueh2的DNA序列长度为2 481 bp,其中包含了5′端和3′端侧翼调控序列,6个内含子序列和编码cDNA序列。开放阅读框序列长度为1 188 bp,编码395个氨基酸,对应的蛋白质命名为AuEH2;该蛋白质为无信号肽的亲水蛋白质,其理论相对分子质量44.6 kD;其叁维结构包含EH典型的"α/β"核心催化结构域和"帽子"结构域,活性中心由催化叁联体Asp191、His369和Glu343组成。本课题研究成果为深入研究AuEH2及其应用奠定了基础。(本文来源于《食品与生物技术学报》期刊2013年12期）
张慧敏[7]（2013）在《计算机辅助设计提高宇佐美曲霉GHF11木聚糖酶热稳定性的研究》一文中研究指出β-1,4-内切木聚糖酶(EC3.2.1.8)是一类从木聚糖主链的内部随机切割β-1,4木糖苷键的水解酶，简称木聚糖酶。近年来，随着人们对自然界半纤维素资源的开发和低聚木糖生理功能的发现，木聚糖酶获得了广泛的应用。宇佐美曲霉(Aspergillus usamii) E001可产具高催化活性的中温木聚糖酶，为了进一步提高木聚糖酶的活力，并探讨其耐热机制，本论文克隆和表达了来自A. usamii E001的糖苷水解酶11家族(GHF11)木聚糖酶AusXyn11D及AusXyn11A的基因序列。并以具高比酶活的AusXyn11A为研究对象，通过分子动力学模拟的方法指导其N端替换，以改善其热稳定性，此外，还分析了杂合木聚糖酶的耐热机制及水解产物特性。以曲霉基因组中的木聚糖酶保守序列为基础，利用多种PCR技术获得A. usamiiE001木聚糖酶基因Ausxyn11D的完整cDNA和DNA序列，其GenBank登录号分别为JQ219105和HQ724287。氨基酸序列同源性分析结果表明AusXyn11D具有GHF11木聚糖酶高度保守的氨基酸片段及催化活性中心，且与A. usamii E001中两种已知的GHF11木聚糖酶的同源性分别为58%和37%。同源建模结果显示，AusXyn11D具有GHF11木聚糖酶典型的“右手”型结构，表明AusXyn11D属于GHF11木聚糖酶。依据Ausxyn11D的cDNA序列设计引物，利用RT-PCR技术克隆其成熟肽基因，同时根据GenBank中A. usamii E001GHF11木聚糖酶AusXyn11A的基因序列，扩增得到成熟肽基因Ausxyn11A，然后，成功构建毕赤酵母(Pichia pastoris) GS115重组子GS115/Ausxyn11D及GS115/Ausxyn11A。经甲醇诱导表达后，重组木聚糖酶reAusXyn11D、reAusXyn11A的比酶活分别达到150.3U/mg和22,714U/mg； reAusXyn11D和reAusXyn11A的Topt分别为55℃和50℃，分别在50℃和45℃以下稳定，最适pH值均偏酸性，且pH稳定范围分别为3.5~6.5和4.0~8.0。但与reAusXyn11D相比，reAusXyn11A具有高比酶活的优点，因此具有重要的工业应用价值。此外，为了获得高产木聚糖酶的基因工程菌株，对GS115/Ausxyn11A的发酵条件进行优化，reAusXyn11A的酶活最高可达912.6U/mL，是优化前的2.14倍。对文献报道的耐热木聚糖酶EvXyn11TS基因序列进行毕赤酵母密码子优化，人工合成其优化基因Syxyn11，并在P. pastoris GS115中获得表达，重组木聚糖酶reSyXyn11的比酶活为363.2U/mg，Topt可高达85℃，并在80℃以下稳定，最适pH值为6.5，在pH4.5~9.0的范围内稳定，是目前最耐热的GHF11木聚糖酶之一。通过分子动力学模拟的方法分析AusXyn11A和EvXyn11TS的N端序列，确定用EvXyn11TS的Asn1-Arg38区域替换AusXyn11A中的Ser1-Ala33区域，以此构建杂合酶AEXynM。重组杂合木聚糖酶reAEXynM的比酶活为19,237U/mg，稍低于reAusXyn11A。reAEXynM的Topt为70℃，75℃以下稳定，较reAusXyn11A有显着性提高，其Tm值可高达91.6℃，虽略低于文献报道的EvXyn11TS的Tm值，但比reAusXyn11A提高了34.0℃，表明杂合酶的热稳定性大大提高了。采用分子动力学模拟的方法分析AEXynM与AusXyn11A中的差异氨基酸，并结合分子间作用力的分析，推测与AEXynM热稳定性相关的位点为Cys5、Pro9及His14，以此构建突变酶基因，获得重组突变酶reAEXynMC5T、reAEXynMP9S和reAEXynMH14N。叁种突变酶的热稳定性均出现一定程度的下降，其中reAEXynMC5T的热稳定性最差，证实N端二硫键(Cys5-Cys32)的添加是AEXynM热稳定性提高的主要原因之一；而reAEXynMP9S和reAEXynMH14N则表现出相对微弱的下降，结构分析表明，Pro9可提高β-转角的刚性，而His14与Phe17可形成氢键，加固了β-折迭B1与B2之间的连接，是影响AEXynM热稳定性的重要因素。以玉米芯木聚糖及桦木木聚糖为底物，研究AEXynM的水解过程及产物，研究结果显示玉米芯木聚糖的水解产物以木二糖和木叁糖为主，分别占水解产物总量的42.33%和38.76%；而桦木木聚糖的水解产物主要以木二糖为主，可占水解产物总量的58.56%；两种底物的水解液中仅有少量木糖被检出，表明其在低聚木糖制备方面具有极大的应用潜力。(本文来源于《江南大学》期刊2013-12-01）
龚燕燕,殷欣,邬敏辰,曾妍[8]（2013）在《宇佐美曲霉阿魏酸酯酶A基因的克隆表达及酶学性质研究》一文中研究指出本研究通过RT-PCR技术从宇佐美曲霉(Aspergillus usamii)E001中克隆了编码阿魏酸酯酶A的成熟肽cDNA(AusfaeA),构建重组表达质粒pPIC9K-AusfaeA,将其经SacⅠ线性化后转化毕赤酵母(Pichia pastoris)GS115,通过抗G418筛选获得高拷贝重组子GS115/AusfaeA,用甲醇诱导表达重组阿魏酸酯酶(reAusFaeA)。SDS-PAGE显示,纯化后的reAusFaeA为单一条带,其表观相对分子质量为36 000;以阿魏酸甲酯为底物,经高效液相色谱法测定,该酶的酶活为29.4 U/mg;reAusFaeA的最适反应温度为45℃,并在45℃以下稳定;最适反应pH为5.0,在pH 4.0~6.0范围内稳定;多数测定的金属离子及EDTA对该酶的活性影响不大。结果表明在P.pastoris中成功实现了AusfaeA的异源表达,该重组酶优良的酶学性质表明其具有较大的工业应用潜力。(本文来源于《食品与生物技术学报》期刊2013年07期）
闵柔,黄芳,曾妍,邬敏辰,吴静[9]（2013）在《宇佐美曲霉羧肽酶成熟肽基因的表达及鉴定》一文中研究指出目的克隆、表达宇佐美曲霉(Aspergillus usami)羧肽酶成熟肽基因,并检测其酶学性质。方法根据前期克隆的宇佐美曲霉羧肽酶基因序列设计引物,克隆羧肽酶成熟肽基因AucpA,构建重组表达质粒pPIC9k-AucpA,电击转化毕赤酵母GS115,甲醇诱导重组蛋白表达。表达的重组蛋白经Sephadex-50层析纯化后,进行酶活性及其影响因素的检测。结果重组表达质粒pPIC9K-AucpA经双酶切及测序证明构建正确;表达的重组蛋白相对分子质量约81 000,纯化的重组羧肽酶最高比酶活为57.15 nkat/mg,最适反应温度为45℃,最适反应pH为3.5,金属离子、EDTA对重组羧肽酶的酶活性无影响,而PMSF对重组羧肽酶酶活性的抑制率达50%以上。结论已成功在毕赤酵母中表达了具有较高酶活的宇佐美曲霉羧肽酶,为进一步研究该重组酶的应用奠定了基础。(本文来源于《中国生物制品学杂志》期刊2013年02期）
李硕然[10]（2012）在《宇佐美曲霉酸性蛋白酶基因在黑曲霉中表达的研究》一文中研究指出酸性蛋白酶是一类最适pH为2.5-5.0的天冬氨酸蛋白酶。真菌酸性蛋白酶能在低pH条件下,有效水解蛋白质,被广泛应用于酒精、酿酒、食品加工、饲料添加、皮革加工等行业中,是酶制剂产业的一个重要产品,具有很好的商业开发价值。宇佐美曲霉(aspergillus usamii)是传统的酸性蛋白酶发酵生产菌,目前利用常规的育种方法提高其产量的潜力已经非常有限,通过基因工程技术培育工程菌是获得酸性蛋白酶高产菌株的有效途径。黑曲霉是一种因其酶系丰富、代谢产物多而被广泛应用的工业生微生物。黑曲霉作为基因工程的受体菌有着与细菌、酵母不同的独特优点——具有很高的蛋白质分泌能力,一些糖化酶生产菌种在理想的培养条件下发酵分泌糖化酶的产率可达20g/L发酵液；能够正确进行各种翻译后加工,并且与高等真核生物类似；同时又是公认的安全生产菌株,发酵及后处理技术成熟。宇佐美曲霉与黑曲霉同为曲霉属,具有相同的基因表达调控机制。因此以黑曲霉糖化酶基因启动子调控宇佐美曲霉酸性蛋白酶基因的表达,有望获得高效表达酸性蛋白酶的黑曲霉工程菌,从而达到提高酸性蛋白酶产量和简化发酵条件的目的。本研究以宇佐美曲霉(aspergillus usamii)为基因供体,通过重迭延伸PCR将宇佐美曲霉酸性蛋白酶基因pepA与黑曲霉糖化酶基因的5’同源臂和3’同源臂进行拼接,构建pepA基因的表达框,使酸性蛋白酶基因受糖化酶启动子的调控。进一步构建黑曲霉表达载体,通过农杆菌介导法转化黑曲霉菌丝体,培育酸性蛋白酶工程菌。主要研究结果如下：1.黑曲霉表达载体的构建采用PCR扩增方法,分别获得宇佐美曲霉中的酸性蛋白酶基因pepA,黑曲霉糖化酶基因的上游片段GLA5和下游片段GLA3。运用重迭延伸PCR,将GLA5、GLA3与pepA基因拼接,得到酸性蛋白酶同源重组表达框GLA5-pepA-GLA3。构建农杆菌介导转化黑曲霉的表达载体pSZH-pepA,其T-DNA区顺向连接酸性蛋白酶基因和潮霉素基因两个同源重组表达框。2.农杆菌介导的黑曲霉菌丝体遗传转化体系的建立与优化从潮霉素B和头孢噻肟钠的筛选压力、乙酰丁香酮浓度、培养基的选择、黑曲霉菌龄、共培养时间以及共培养温度等方面,对农杆菌介导的黑曲霉菌丝体遗传转化体系进行摸索,最终确定以PDA作为共培养培养基,乙酰丁香酮浓度为200μmol/L的条件下,用菌龄为5d的黑曲霉菌丝体与携带表达载体的农杆菌,在28℃恒温培养箱中静置共培养48h为最佳转化条件。3.酸性蛋白酶基因在黑曲霉中表达以高产糖化酶的黑曲霉工业生产菌种为受体菌,采用根癌农杆菌介导法将表达载体pSZH-pepA化黑曲霉菌丝体,经PCR鉴定,在69株稳定遗传的菌株中,共有37株为阳性菌株,其中3株为同源重组转化子。挑取稳定转化子于糖化酶糖化酶摇瓶发酵培养基中,34℃条件下300r/min培养3d。取培养液上清,经TCA法浓缩蛋白后,进行SDS-PAGE,得到约40Kda酸性蛋白酶条带,说明在糖化酶生产条件下,转入的酸性蛋白酶基因获得了表达。进一步对重组菌株的发酵液上清进行福林—酚法测定酶活,结果表明,酸性蛋白酶基因在黑曲霉中得到了表达,酶活最高达45.56U/mL,而在出发菌株中检测到的酸性蛋白酶酶活仅为3.72U/mL,说明转入的pepA基因已在糖化酶基因启动子调控下获得了表达。4.黑曲霉重组菌株摇瓶发酵条件的优化将重组菌株在不同条件下摇瓶发酵,探讨pH、培养温度、培养时间对产酶量的影响,确定适合重组菌摇瓶发酵的条件。结果表明,重组菌在初始pH为5.0,培养温度为34℃,培养时间为72h,产酶量较为理想。在此条件下,重组菌的发酵酶活可达45.56U/mL。(本文来源于《东北农业大学》期刊2012-04-06）
宇佐美曲霉论文开题报告
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
乙酰木聚糖酯酶(EC 3.1.1.72)于上世纪90年代被发现,是木聚糖降解酶系的关键酶之一,其在乙酰化木聚糖降解过程中的主要作用是消除D-木糖残基C2和C3位上的O-乙酰取代基团。天然微生物的乙酰木聚糖酯酶存在表达量低、酶活性低以及产物不纯等缺点,其应用受到局限。本论文将来自宇佐美曲霉(Aspergillus usamii)E001的乙酰木聚糖酯酶基因在毕赤酵母(Pichia pastoris)GS115中实现异源表达,并对其相关酶学性质进行了研究。以宇佐美曲霉(A.usamii)E001总RNA为模板,利用软件Oligo 7.0设计引物Auaxe-F和Auaxe-R,进行RT-PCR扩增出编码乙酰木聚糖酯酶的c DNA基因(Auaxe),构建重组克隆载体p UCm-T-Auaxe进行保种测序,结果显示该基因序列长828 bp,编码275个氨基酸。将Auaxe序列与表达载体p PIC9KM连接,构建重组表达质粒p PIC9KM-Auaxe,Sal I线性化后电击转入毕赤酵母基因组中,遗传霉素(G418)筛选获得阳性转化重组酵母GS115/Auaxe,经1%甲醇诱导表达72 h,以对硝基苯酚醋酸酯为底物,50℃、p H 6.0条件下通过分光光度法测得重组乙酰木聚糖酯酶(re Au Axe)的酶活性为35.6 U/m L。此外,为了提高乙酰木聚糖酯酶蛋白的表达量,对GS115/Auaxe的诱导表达条件进行了优化,re Au Axe的酶性活最高达到98.5 U/m L,是优化前的2.11倍。采用(NH4)2SO4沉淀、DEAE-52阴离子交换层析和透析的方法对重组乙酰木聚糖酯酶粗酶液进行分离纯化。结果表明,其纯化倍数为1.7,回收率为63.1%,SDS-PAGE电泳结果显示纯化后的乙酰木聚糖酯酶在34.0 k Da处有一条清晰条带,测其比酶活为390.5 U/mg。该酶最适作用p H为6.0,在p H 4.5~7.0之间性质较稳定;最适作用温度为50℃,在45℃及以下性质稳定;所测金属离子及EDTA对该酶活性影响不明显;以对硝基苯酚醋酸酯为底物,在50℃、p H 6.0的条件下,该酶的Km和Vmax值分别为0.72mmol/L和555.6 U/mg。以小麦麸皮为研究对象,探究重组乙酰木聚糖酯酶分别与重组木聚糖酶(re Au Xyn11A和re Au Xyn10A)、重组纤维素酶(re Au Cel12A)及复合酶之间的协同作用。结果表明,当re Au Axe与re Au Xyn11A的酶量比为5:1时协同效果较好,还原糖生成量比re Au Xyn11A单独作用增加了46%;当re Au Axe与re Au Xyn10A的酶量比为5:1时协同效果较好,还原糖生成量增加了16%;同样re Au Axe与re Au Cel12A以5:1添加时,还原糖生成量比re Au Cel12A单独作用增加了28.4%;re Au Axe与复合酶以5:1添加时,还原糖生成量提高了33.6%。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
宇佐美曲霉论文参考文献
[1].胡蝶.宇佐美曲霉环氧化物水解酶的基因克隆、分子改造及在手性化合物合成中的应用[D].江南大学.2017
[2].朱天地.宇佐美曲霉乙酰木聚糖酯酶的基因克隆、表达及酶学性质研究[D].江南大学.2015
[3].汪俊卿.宇佐美曲霉木聚糖酶AusXyn10A的克隆表达及耐热性的改造研究[D].江南大学.2014
[4].杨琥.宇佐美曲霉酸性蛋白酶在毕赤酵母中的表达及其酶学性质的研究[D].湖北大学.2014
[5].龚燕燕,殷欣,唐存多,邬敏辰,曾妍.宇佐美曲霉阿魏酸酯酶与木聚糖酶协同作用降解小麦麸皮制备阿魏酸[J].中国生物制品学杂志.2014
[6].胡蝶,朱利娟,邬敏辰,汪俊卿,唐存多.宇佐美曲霉环氧化物水解酶基因的克隆与生物信息学分析[J].食品与生物技术学报.2013
[7].张慧敏.计算机辅助设计提高宇佐美曲霉GHF11木聚糖酶热稳定性的研究[D].江南大学.2013
[8].龚燕燕,殷欣,邬敏辰,曾妍.宇佐美曲霉阿魏酸酯酶A基因的克隆表达及酶学性质研究[J].食品与生物技术学报.2013
[9].闵柔,黄芳,曾妍,邬敏辰,吴静.宇佐美曲霉羧肽酶成熟肽基因的表达及鉴定[J].中国生物制品学杂志.2013
[10].李硕然.宇佐美曲霉酸性蛋白酶基因在黑曲霉中表达的研究[D].东北农业大学.2012