检测牛副流感病毒3型血清抗体的间接ELISA建立及应用

论文摘要

牛副流感病毒3型(Bovine parainfluenza virus type 3,BPIV3)的基因组是负链RNA,属副黏病毒科呼吸道病毒属成员,是引起牛呼吸道疾病综合征的主要病原之一。该病毒引发的牛呼吸道疾病多发于长途运输之后,故又称为运输热病毒。我国于2008年首次检测到了基因C型的BPIV3,随后开展了一些相关的研究。国内目前在检测BPIV3血清抗体时主要是病毒中和试验,该方法不适合血清的大规模检测,而ELISA是目前检测动物传染病血清抗体的常用方法。为此,本研究开展了建立检测BPIV3血清抗体的间接ELISA方法的研究,为国内BPIV3的防控提供技术支持。BPIV3的核衣壳蛋白(NP)是病毒粒子中含量较高的一个结构蛋白,能诱导机体产生相应的抗体。为此,本研究采用原核表达的方式,表达了牛副流感病毒3型的核衣壳蛋白。通过优化诱导表达条件,使得NP蛋白呈部分可溶性表达。利用Ni柱在非变性条件下纯化了重组蛋白NP。利用方阵滴定确定了包被抗原蛋白浓度为0.8μg/mL,血清样品的最佳稀释度为1:200倍,再对ELISA的反应条件进行优化,建立了检测牛副流感病毒3型血清抗体的间接ELISA方法。特异性实验表明重组蛋白NP不与牛传染性鼻气管炎病毒和牛病毒性腹泻病毒阳性血清发生交叉反应。重复性实验表明该方法具有较好的稳定性。当BPIV3阳性牛血清在稀释至1:640时仍为阳性,具有较高的敏感性。对94份牛血清的比对检测表明,本研究建立的以重组蛋白NP为包被抗原的间接ELISA方法与病毒中和试验的符合率为98%。同时,本研究以裂解的BPIV3作为包被抗原,建立了检测BPIV3血清抗体的间接ELISA方法。首先采用蔗糖密度梯度离心法纯化BPIV3,测定病毒蛋白浓度后充分裂解病毒,用方阵滴定确定了包被抗原蛋白浓度为0.2μg/mL,血清最佳稀释度为1:50倍,然后进一步优化了ELISA的反应条件。特异性实验表明包被的裂解BPIV3不与牛传染性鼻气管炎病毒和牛病毒性腹泻病毒阳性血清发生交叉反应。重复性实验表明该方法亦具有较好的稳定性。当BPIV3阳性牛血清在稀释至1:1280时仍为阳性,表明该方法具有较高的敏感性。对94份牛血清的比对检测表明,本研究建立的以裂解BPIV3为包被抗原的间接ELISA方法与病毒中和试验的符合率为98.9%。用上述两种间接ELISA方法分别检测了394份接种过BPIV3灭活疫苗的牛血清样品,结果显示两种方法检测的牛血清均呈强阳性。此外,用重组蛋白NP作为包被抗原的间接ELISA方法检测了95份未接种BPIV3疫苗的牛血清样品,阳性率为80%。随后用建立的以裂解病毒作为包被抗原的间接ELISA方法检测了591份未接种BPIV3疫苗的牛血清,阳性率为91%。从上述两种间接ELISA方法与病毒中和试验的检测结果比对来看,以裂解的病毒作为包被抗原的间接ELISA方法与病毒中和试验的符合率较高,比较适合BPIV3血清抗体的检测。本研究为BPIV3的血清流行病学调查和疫苗免疫检测提供了技术支持。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 英文缩略表
• 第一章 引言
•   1.1 牛副流感病毒的概况
•     1.1.1 病毒的主要特征
•     1.1.2 临床症状及发病机理
•     1.1.3 病毒感染后的机体免疫应答
•   1.2 病毒的复制和转录
•   1.3 诊断方法
•   1.4 BPIV3感染的防控
•   1.5 研究目的及意义
• 第二章 以BPIV3的重组NP蛋白作为包被抗原的间接ELISA方法的建立及应用
•   2.1 材料与方法
•     2.1.1 细胞、质粒、毒（菌）株
•     2.1.2 主要试剂
•     2.1.3 血清样品
•     2.1.4 扩增NP基因引物设计
•     2.1.5 牛副流感病毒3型RNA提取及NP基因的扩增
•     2.1.6 NP基因的原核表达载体的构建
•     2.1.7 NP基因的原核表达、鉴定、表达优化和蛋白纯化
•     2.1.8 NP蛋白作为包被抗原的间接ELISA方法建立
•     2.1.9 包被条件的确定
•     2.1.10 封闭试剂和封闭时间的确定
•     2.1.11 二抗最佳稀释比例的确定
•     2.1.12 二抗最佳孵育时间的确定
•     2.1.13 显色液最佳显色时间的确定
•     2.1.14 临界值的确定
•     2.1.15 鉴定特异性实验
•     2.1.16 敏感性实验
•     2.1.17 重复性实验
•     2.1.18 与病毒中和试验的符合率实验
•     2.1.19 建立的间接ELISA方法的初步应用
•   2.2 结果
•     2.2.1 NP基因的扩增
•     2.2.2 NP基因原核表达条件的优化
•     2.2.3 NP蛋白的原核表达鉴定及纯化
•     2.2.4 方阵滴定确定血清的稀释度和包被浓度
•     2.2.5 优化包被条件
•     2.2.6 优化封闭条件
•     2.2.7 二抗稀释最佳比例的确定
•     2.2.8 二抗最佳孵育时间的确定
•     2.2.9 显色液的最佳显色时间的确定
•     2.2.10 临界值的确定
•     2.2.11 特异性实验
•     2.2.12 敏感性实验
•     2.2.13 重复性实验
•     2.2.14 与病毒中和试验的符合率
•     2.2.15 建立的间接ELISA方法的初步应用
•   2.3 讨论
• 第三章 以裂解的全病毒作为包被抗原的间接ELISA方法的建立及其初步应用
•   3.1 材料与方法
•     3.1.1 细胞和毒株
•     3.1.2 主要试剂
•     3.1.3 血清样品
•     3.1.4 病毒的培养与纯化
•     3.1.5 裂解的全病毒作为包被抗原的间接ELISA方法建立
•     3.1.6 包被条件的确定
•     3.1.7 封闭试剂和封闭时间的确定
•     3.1.8 二抗最佳稀释比例的确定
•     3.1.9 二抗最佳孵育时间的确定
•     3.1.10 显色液最佳显色时间的确定
•     3.1.11 临界值的确定
•     3.1.12 鉴定特异性实验
•     3.1.13 敏感性实验
•     3.1.14 重复性实验
•     3.1.15 与病毒中和试验的符合率实验
•     3.1.16 建立的间接ELISA方法的初步应用
•   3.2 结果
•     3.2.1 病毒纯化后的鉴定及TCID50测定
•     3.2.2 方阵滴定确定血清的稀释度和抗原包被浓度
•     3.2.3 优化抗原包被条件
•     3.2.4 优化封闭条件
•     3.2.5 二抗稀释最佳比例的确定
•     3.2.6 二抗最佳孵育时间的确定
•     3.2.7 显色液的最佳显色时间的确定
•     3.2.8 临界值的确定
•     3.2.9 特异性实验
•     3.2.10 敏感性实验
•     3.2.11 重复性实验
•     3.2.12 与病毒中和试验的符合率
•     3.2.13 间接ELISA方法的应用
•   3.3 讨论
• 第四章 全文结论
• 参考文献
• 致谢
• 作者简历

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 李德栋

导师: 薛飞

关键词: 牛副流感病毒型,蛋白,全病毒,间接

来源: 中国农业科学院

年度: 2019

分类: 基础科学,农业科技

专业: 生物学,畜牧与动物医学

单位: 中国农业科学院

基金: 国家重点研发课题“牛羊虫媒病和慢病毒病的诊断与检测新技术研究(2016YFD0500908)”

分类号: S852.65

总页数: 62

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