拟南芥kea3-S突变体的光合特性研究

论文摘要

光合作用生成ATP和NADPH用于固定CO2产生碳水化合物以及合成一系列自养生长必不可少的化合物,实现了光能向化学能的转换。光合电子传递过程中类囊体囊腔积累的大量质子形成了跨膜质子驱动力pmf,来驱动ATP的合成。根据Mitchell化学渗透假说,pmf由两个组分组成,分别为跨膜质子浓度梯度?pH和跨膜电位梯度Δψ。已有研究表明二者在热力学上是等效的。在线粒体中,Δψ是pmf中维持催化反应更有效的组分,而在叶绿体中,?pH是pmf的主要组分,Δψ必须被快速的耗散,从而使类囊体囊腔维持有效的pH。在叶绿体中,由于一些离子(比如Cl-,K+,Mg2+)进出囊腔,Δψ很快被耗散,?pH取代Δψ成为pmf的主要组分。这些离子进出类囊体需要依赖于离子通道蛋白或者离子转运体。目前已经报道了定位于叶绿体类囊体膜上的K+通道蛋白TPK3、K+/H+协同转运蛋白KEA3以及Cl-转运蛋白AtBest等多种离子通道蛋白和离子转运体,但它们是如何协同运作的目前还不清楚。为了研究光合作用过程中Δψ调节的分子机理,我们筛选获得了NPQ诱导缺陷的突变体kea3-S。突变体kea3-S的突变发生在KEA3基因的第709 bp处,其编码的蛋白在第237位,氨基酸突变为丝氨酸。拟南芥KEA3蛋白已被证实是一个K+/H+协同转运蛋白,它利用K+交换H+,从而降低囊腔pH,维持类囊体囊腔的质子浓度。光诱导NPQ和光饱和ETR曲线测定结果显示,突变体的NPQ和ETR水平分别明显或稍微低于WT,说明这个点突变导致KEA3蛋白的构象发生了改变,从而使它加速泵出H+,导致跨膜质子梯度降低,继而引起电子传递速率的降低。为了研究KEA3和Cl-通道蛋白AtBest如何协同调节光合跨膜电位,我们构建了双突变体kea3-S best1-2,光合特性测定分析发现kea3-S best1-2的Δψ水平较野生型偏高,NPQ诱导水平显著低于野生型和单突变体;叶绿素荧光分析发现PSII受体侧的还原程度较野生型偏高,PSI供体侧氧化程度较野生型偏低,表明kea3-S best1-2双突变体中电子由质体醌向下传递受阻,同时质体蓝素能够接受到足够多的电子;蛋白质免疫印迹和蓝绿温和电泳分析结果表明,AtBest蛋白缺失和Kea3点突变导致KEA3氨基酸的改变不影响光合作用相关蛋白及类囊体膜复合物的累积;这些结果表明KEA3和AtBest的活性调节对于维持类囊体囊腔内质子浓度发挥着重要的作用。综上所述,AtBest蛋白和KEA3蛋白协同调节质子在类囊体囊腔内的累积,继而调控光合电子传递及跨膜电位,相关工作对揭示跨膜电位Δψ调控光合作用的分子机理具有重要的生物学意义。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第1章 绪论
•   1.1 光合作用概述
•     1.1.1 光合作用定义
•     1.1.2 光合作用过程
•   1.2 叶绿素荧光
•   1.3 非光化学猝灭（NPQ）
•   1.4 叶绿体类囊体膜通道蛋白研究概况
•     1.4.1 钾离子通道
•     1.4.2 氯离子通道
•     1.4.3 类囊体水通道
•     1.4.4 离子泵
•     1.4.5 其他离子转运体
•   1.5 质子驱动力-pmf
•     1.5.1 化学渗透假说
•     1.5.2 质子驱动力的组成与分配
•     1.5.3 质子驱动力（pmf）调控光合作用
•   1.6 研究目的和意义
• 第2章 材料与方法
•   2.1 实验材料和培养条件
•     2.1.1 实验材料
•     2.1.2 培养条件
•   2.2 实验方法
•     2.2.1 图位克隆
•     2.2.2 拟南芥kea3-S best1-2基因的克隆
•     2.2.3 拟南芥基因组DNA提取
•     2.2.4 拟南芥KEA3蛋白特异性抗体制备
•     2.2.5叶绿体蛋白提取实验
•     2.2.6 SDS-PAGE
•     2.2.7 BN-PAGE
•     2.2.8 ECS信号检测
•     2.2.9 叶绿素荧光测量
• 第3章 实验结果
•   3.1 突变体的筛选
•   3.2 突变基因的克隆
•   3.3 kea3-S best1-2双突变体的构建
•   3.4 光合电子传递速率及供体和受体侧的氧化还原状态分析
•   3.5 不同光强下NPQ诱导水平检测
•   3.6 变化光下NPQ诱导水平检测
•   3.7 突变体中叶绿体类囊体跨膜质子驱动力的检测
•   3.8 KEA3 蛋白特异性抗体制备
•   3.9 叶绿体类囊体膜复合物及光合作用相关蛋白的累积分析
•     3.9.1 BN-PAGE检测叶绿体类囊体膜相关复合物的累积情况
•     3.9.2 KEA3 复合物定位
•     3.9.3 Western-Blot检测光合作用相关蛋白的累积情况
• 第4章 讨论
•   4.1 NPQ诱导缺陷相关突变体的筛选
•   4.2 AtBest蛋白和KEA3蛋白是参与植物光保护过程
•   4.3 AtBest蛋白和KEA3蛋白是调控质子驱动力pmf分配所必需
•   4.4 AtBest蛋白和KEA3蛋白不影响光合作用调控相关复合物及蛋白的累积
• 第5章 结论与展望
• 参考文献
• 功读学位期间取得的研究成果
• 致谢

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 张琪琪

导师: 彭连伟

关键词: 光合作用,质子驱动力,跨膜电位

来源: 上海师范大学

年度: 2019

分类: 基础科学

专业: 生物学

单位: 上海师范大学

分类号: Q945.11

总页数: 61

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