表达ASFV保护性抗原重组腺病毒载体疫苗的初步研制

论文摘要

非洲猪瘟 ASF（African swine fever）,是由非洲猪瘟病毒 ASFV（African swine fever virus）引起的家猪及野猪高死亡率的一种疾病。ASFV是大型双链DNA病毒,长约180 kb,编码蛋白多达180个。ASFV主要通过接触传播,短距离内也可通过空气传播,感染猪肺泡巨噬细胞引起家猪及野猪急性高热症状。目前,ASFV现已传播至中国大部分省市,造成了巨大的经济损失。迄今为止,尚无有效的ASFV疫苗,重组腺病毒载体疫苗能够诱导坚强的细胞免疫及体液免疫应答,且安全性更高。因此,本研究旨在制备表达多种ASFV保护性抗原的重组腺病毒载体,为研究ASF重组腺病毒载体疫苗提供借鉴。EP153R（EP153R）、CD2v（EP402R）、p54（E183L）和 p72（B646L）蛋白在 ASFV 复制、包装等过程中均具有重要作用,是ASFV重要的保护性抗原。以EGFP为标签蛋白,构建pShuttle-EGFP-EP 1 53R-EP402R、pShuttle-EGFP-EP153R-E183L 和 pShuttle-EGFP-B646L;为提高免疫效果,以CTLA4部分序列为先导序列,构建pShuttle-CTLA4-EP 153R-EP402R、pShuttle-CTLA4-EP153R-E183L 和 pShuttle-CTLA4-B646L,构建完成的载体分别转染 293T 细胞,western blot对融合蛋白表达进行验证（pShuttle-CTLA4-B646L不表达）,正确表达的质粒转化到BJ5183大肠杆菌重组菌株中,分别重组为pAd-EGFP/CTLA4-EP 153R-EP402R、pAd-EGFP/CTLA4-EP153R-E183L 和 pAd-EGFP-B646L 重组腺病毒载体,转染 293A 细胞包装重组腺病毒,重组腺病毒皮下注射小鼠进行免疫,一免后7天进行加强免疫,分别于一免后14d、30d、46d采血收集血清,使用原核表达产物EP153R蛋白及EGFP蛋白检测血清中特异性抗体产生水平;一免后50d采集脾脏及腋下、腹股沟淋巴结,使用原核表达蛋白EP153R与EGFP蛋白刺激淋巴细胞,分别检测脾脏及淋巴结细胞增殖水平;同时使用流式细胞仪检测抗原刺激后CD3+细胞中IFN-γ+细胞比例,分析重组腺病毒免疫后小鼠对同种抗原的识别及反应程度。结果表明:成功构建的5种融合表达ASFV保护性抗原的重组腺病毒免疫小鼠后,均能诱导小鼠产生特异性抗体,且CTLA4为佐剂的重组腺病毒免疫组能引起更好的体液免疫,EP153-CD2v 比EP153R-p54蛋白引起的体液免疫更强,EGFP-p72蛋白引起的体液免疫反应较弱;淋巴细胞增殖实验显示,Ad-EGFP-p72免疫组淋巴细胞经EGFP蛋白刺激后可增殖分化,其余免疫组经EP153R刺激后无明显增殖。流式结果与淋巴细胞增殖实验相符,EGFP蛋白刺激Ad-EGFP-p72免疫组有特异性IFN-y分泌,其余组经EP153R蛋白刺激后无明显变化。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 缩略词表（Abbreviation）
• 文献综述
•   1.1 非洲猪瘟病原学
•     1.1.1 ASFV形态结构
•     1.1.2 理化性质
•     1.1.3 基因组结构
•     1.1.4 相关蛋白简介
•     1.1.5 ASFV复制
•   1.2 非洲猪瘟流行病学
•     1.2.1 普通流行病学
•     1.2.2 分子流行病学
•   1.3 临床症状及作用机制
•   1.4 实验室诊断技术
•     1.4.1 病毒核酸检测
•     1.4.2 血清学诊断
•   1.5 免疫与疫苗
•     1.5.1 灭活疫苗
•     1.5.2 减毒活疫苗
•     1.5.3 DNA疫苗
•     1.5.4 亚单位疫苗
•     1.5.5 其他防治策略
• 第一章 重组腺病毒载体构建及重组腺病毒制备
•   1.1 材料
•     1.1.1 菌株及质粒
•     1.1.2 主要实验仪器
•     1.1.3 主要试剂
•     1.1.4 常用试剂配制
•   1.2 方法
•     1.2.1 引物设计
•     1.2.2 目的片段获取
•     1.2.3 载体连接
•     1.2.4 pShuttle质粒瞬时表达验证
•     1.2.5 Ad-Shuttle载体重组
•     1.2.6 重组腺病毒包装及滴度测定
•   1.3 结果
•     1.3.1 目的片段PCR扩增
•     1.3.2 载体酶切验证
•     1.3.3 WB检测目的蛋白表达
•     1.3.4 重组腺病毒载体验证
•     1.3.5 重组腺病毒表达目的蛋白WB检测
•     1.3.6 重组腺病毒TCID50测定
•   1.4 讨论
• 第二章 重组腺病毒感染小鼠及其效果检测
•   2.1 材料
•     2.1.1 实验动物及质粒
•     2.1.2 主要试剂
•     2.1.3 常用试剂配制
•   2.2 方法
•     2.2.1 小鼠免疫
•     2.2.2 EGFP及EP153R原核表达
•     2.2.3 血清抗体检测
•     2.2.4 淋巴细胞增殖实验
•     2.2.5 流式细胞分析
•   2.3 结果
•     2.3.1 EGFP及EP153R原核表达
•     2.3.2 血清抗体效价检测
•     2.3.3 淋巴细胞增殖实验
•     2.3.4 流式细胞术检测
•   2.4 讨论
• 全文结论
• 参考文献
• 致谢

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 谢灵志

导师: 张泉,朱鸿飞

关键词: 非洲猪瘟病毒,重组腺病毒,保护性抗原,免疫评价

来源: 扬州大学

年度: 2019

分类: 基础科学,农业科技

专业: 生物学,畜牧与动物医学

单位: 扬州大学

基金: 国家重点研发计划课题(表达非洲猪瘟病毒保护性抗原病毒活载体疫苗和亚单位疫苗的研制,2017YFD0502303)

分类号: S852.651

DOI: 10.27441/d.cnki.gyzdu.2019.000279

总页数: 58

文件大小: 4320K

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