导读:本文包含了孵化酶论文开题报告文献综述、选题提纲参考文献及外文文献翻译，主要关键词:基因,家蚕,鱼卵,组织,免疫,特性,化学。
孵化酶论文文献综述
浦月霞,刘龙山,龚美霞,冉艳萍,贾雪峰[1]（2018）在《樗蚕孵化酶基因的克隆与表达特征分析》一文中研究指出樗蚕(Philosamia cynthia cynthia)是重要的野蚕资源。为从分子水平研究樗蚕的孵化机制,以催青第9天的樗蚕卵为材料提取总RNA并反转录合成c DNA,根据鳞翅目昆虫孵化酶基因的保守序列设计简并引物,通过RACE-PCR获得樗蚕孵化酶基因全长c DNA,命名为Pcc HE(Gen Bank登录号:MH119084)。Pcc HE基因c DNA全长为964 bp,由5'-UTR、3'-UTR和885bp的ORF组成,编码294个氨基酸;Pcc HE蛋白序列含有孵化酶特征序列锌指结合基序和Met-转角基序;基于Pcc HE氨基酸序列与16种动物孵化酶同源氨基酸序列构建的系统进化分析树显示,樗蚕与蓖麻蚕之间的亲缘关系最近。半定量RT-PCR检测Pcc HE在樗蚕胚胎发育早期的表达维持在较低水平,催青第3天小幅度增加,第9天时表达水平开始大幅上升,至孵化前达到最高水平;Pcc HE在5龄3 d幼虫中肠中高水平表达,并且在马氏管中也有表达,这是首次在昆虫马氏管中发现孵化酶基因的表达。上述结果表明,Pcc HE与樗蚕的胚胎发育和孵化密切相关,还可能参与幼虫期的食物消化、蛋白质代谢等生物学过程。(本文来源于《蚕业科学》期刊2018年03期）
刘龙山[2]（2018）在《家蚕孵化酶基因启动子功能分析及其转录因子的初步筛选》一文中研究指出孵化酶(Hatching Enzyme,HE)是动物胚胎孵化过程中起消化卵壳或卵膜作用的一类蛋白酶。目前,本课题组已报道家蚕孵化酶基因(BmHE I和BmHE II),两基因转录本均在家蚕胚胎发育后期高量表达,在孵化前期表达量达到最高峰。此外,BmHE I在幼虫期的中肠组织中特异性表达,BmHE II在五龄幼虫期至蛾期的精巢组织中特异性表达。为探索两家蚕孵化酶基因的组织特异性表达调控,本研究对两种家蚕孵化酶基因启动子进行功能分析,构建均一化全长cDNA文库,利用酵母单杂交的方法对其结合启动子的转录因子进行初步筛选。本研究主要获得以下结果:1.体外分析家蚕孵化酶基因I启动子活性:克隆BmHE I基因5’端依次截短的启动子片段分别插入到pGL3.0-Basic载体中构建报告载体,与pRL-CMV内参载体共同转染家蚕BmN细胞。结果表明:在BmN细胞内,BmHE I基因上游1.3kb的启动子能驱萤火虫荧光素酶的表达,但总体活性并不高,基因转录起始位点上游-40至转录起始位点为核心启动子区,删除-97~-40bp区域后其启动子活性明显增加,说明在该区域可能存在转录抑制因子结合位点。2.体内分析家蚕孵化酶基因启动子活性:构建pFBDLuc-P10RLuc双荧光素酶表达转移载体,分别由不同长度的BmHE I和BmHE II启动子片段驱动萤火虫荧光素酶(Luc)作为报告基因,由杆状病毒p10启动子驱动的海肾荧光素酶(Rluc)作为内参基因。通过Bac-to-Bac表达系统制备重组杆状病毒,分别注射五龄起蚕,测定中肠和精巢组织中各不同长度启动子片段的荧光素酶活性。结果表明:在BmHE I启动子中,-886~-509bp之间存在重要的组织特异性转录因子结合位点。在BmHE II启动子中,-1226~-819bp之间存在正调控转录因子结合位点。3.家蚕中肠和精巢组织全长均一化表达cDNA文库的构建:利用DSN酶与SMART技术构建家蚕五龄第3天中肠和精巢组织全长均一化cDNA文库,进一步将均一化文库插入酵母表达载体pGADT7-Sfi上,转化进大肠杆菌进行质粒扩增,并提取质粒。结果表明:中肠组织的初级文库的库容分别为1.9×10~6 cfu,表达文库的平均插入长度大于1kb,重组率为100%,冗余率为3%;精巢组织的初级文库库容为1.8×10~6 cfu,平均插入长度大于1kb,重组率为100%,冗余率为0%。两均一化表达文库质量合格,提取两文库质粒,分别得到质量良好的文库质粒总量各4mg。4.构建酵母诱饵菌株:将BmHE I启动子-543~-90bp(Ip-A)和-990~-486bp(Ip-B)的片段以及合成并叁次串联重复含有HNF-1、GATA-1两个预测元件的(Ip-C)DNA片段作为诱饵片段;将BmHE II启动子扩增-455~-83bp区域(IIp-A)、-866~-398bp(IIp-B)的启动子片段以及合成含有WT1、PEA3、Ftz叁个预测元件并叁次串联重复的(IIp-C)DNA片段作为诱饵片段。成功构建了含BmHE I启动子片段或元件命名分别为Y1HGold[Ip-A-AbAi]、Y1HGold[Ip-B-AbAi]、Y1HGold[Ip-C-AbAi]的3个诱饵酵母菌株以及含BmHE II启动子片段或元件命名分别为Y1HGold[IIp-A-AbAi]、Y1HGold[IIp-B-AbAi]、Y1HGold[IIp-C-AbAi]的3个诱饵酵母菌株。5.利用酵母单杂交方法初步筛选孵化酶基因的转录因子:选取Y1HGold[Ip-B-AbAi]菌株进行中肠cDNA文库筛选,初步筛选出5个可能的转录因子,分别为aspartyl/asparaginyl beta-hydroxylase、leucine-rich repeat-containing protein 70、TBC1domain family member 16、KRR1 small subunit processome component homolog和regucalcin。选取Y1HGold[IIp-B-AbAi]菌株进行精巢cDNA文库筛选,初步筛选出7个可能的转录因子,分别为period(Per)、mimitin,mitochondrial、39S ribosomal protein L51、ribosomal protein L8、UPF0545 protein C22orf39 homolog、zinc finger CCCH domain-containing protein、nucleoporin NUP53。综上所述,本实验通过对家蚕孵化酶基因启动子的研究,找到了一些重要的与组织特异性调控相关的区域,构建家蚕中肠和精巢组织cDNA均一化表达文库,利用酵母单杂交系统初步筛选出与家蚕孵化酶基因启动子相结合的可能的转录因子。研究结果为进一步研究家蚕孵化酶基因的转录表达调控奠定基础。(本文来源于《江苏科技大学》期刊2018-04-26）
浦月霞[3]（2017）在《樗蚕孵化酶基因的克隆与特性分析》一文中研究指出樗蚕(Philosamia cynthia cynthia)又名椿蚕、小桕蚕等,属于鳞翅目大蚕蛾科、樗蚕蛾属的一个物种。樗蚕以蓖麻、乌桕、臭椿(樗)等作为食物,杂食性强、繁殖力强,是园林植物的重要害虫;樗蚕也是泌丝营茧的资源昆虫,茧可用于制丝,蚕蛹可以作为食品或饲料,是重要的经济昆虫。孵化酶(Hatching enzyme,HE)是由胚胎孵化腺细胞分泌的一种蛋白酶,通过降解卵膜/卵壳,使幼虫孵化,进而进行后期的生长发育。本文根据已报道鳞翅目昆虫孵化酶的基因保守序列,用RACE-PCR技术获得樗蚕孵化酶全长序列,对樗蚕孵化酶进行时空表达模式分析、组织表达模式分析、原核表达分析。本文主要获得如下研究结果:(1)利用RACE-PCR和RT-PCR首次获得樗蚕孵化酶的全长cDNA。樗蚕孵化酶基因由5’非翻译区、3’非翻译区和885 bp的开放阅读框组成,全长964 bp,且3’UTR含有一个多聚腺苷酸AATAAA信号。同源序列比对结果表明,樗蚕与蓖麻蚕、野蚕、柞蚕、家蚕、桑蟥、小菜蛾、果蝇和蚊子等昆虫聚类,其中,樗蚕孵化酶与蓖麻蚕孵化酶之间的亲缘关系最近。(2)用软件对PccHE蛋白的叁级结构进行预测,以3lq0.1.A为模板建模得到的叁级结构图,二者同源性为30.88%。GMQE值为0.53,QMEAN为-3.15,因此,此模型的建模结果值得信任。(3)对樗蚕卵胚胎发育的时空表达模式进行分析,PccHE转录本在胚胎发育早期的表达维持在较低水平,在第叁天有一个小幅度增加,第9天时开始剧增,表达水平在孵化前达到最大。随着孵化进度的推进,PccHE转录水平逐渐提高,表明该酶与胚胎发育和孵化密切相关。另外,PccHE的组织表达模式表明,该酶在马氏管、中肠有表达,因此推测PccHE与蛋白质代谢、食物消化等功能相关。(4)实验对PccHE的开放阅读框序列、成熟酶序列、去信号肽序列的蛋白进行SDS-PAGE和Western bloting鉴定分析,有助于今后对该酶进行大量表达,鉴定酶体外活性。本文研究结果初步阐明樗蚕卵孵化的分子机理,为人为掌控樗蚕卵孵化时间和进程,调控樗蚕作为泌丝经济昆虫、蓖麻蚕育种材料和林业害虫时的孵化情况提供理论依据。通过研究樗蚕的孵化机理,为研究其它鳞翅目昆虫的孵化提供借鉴,为研究以孵化相关基因为杀虫剂靶点,抑制卵期胚胎向幼虫的发育,在卵期扼杀鳞翅目害虫提供新的思路。(本文来源于《江苏科技大学》期刊2017-10-01）
浦月霞,刘龙山,龚美霞,冉艳萍,兰艳妮[4]（2017）在《昆虫孵化酶的研究进展》一文中研究指出昆虫孵化酶对生长发育具有重要作用。昆虫种类繁多,而鳞翅目昆虫大多是植食性,为害各种植物。文章针对昆虫孵化机制、昆虫孵化酶的酶学特性及其昆虫孵化酶基因的研究进展进行了综述,为孵化酶在农业害虫生物防治上的应用提供一定的理论基础。(本文来源于《广西蚕业》期刊2017年03期）
陈加佳[5]（2017）在《家蚕孵化酶基因Ⅰ、Ⅱ启动子克隆分析及其转录因子结合位点的初步鉴定》一文中研究指出本课题组业已报道了家蚕的两种孵化酶基因(BmHEⅠ和BmHEII)。在家蚕胚胎发育期,BmHEⅠ和BmHEII基因转录本的相对表达量均随着胚胎发育而上升并在孵化时达到顶峰,两者的瞬时表达性基本与孵化酶基因相吻合。然而,在家蚕幼虫期,在家蚕中肠中检测到BmHEⅠ mRNA,提示其可能具有其他功能;在家蚕精巢组织中检测到BmHEⅡ基因转录本,推测其可能与家蚕的精子发生有关。本研究对两个家蚕孵化酶基因的启动子进行克隆分析并对其部分转录因子结合位点进行初步鉴定。本研究主要获得以下叁部分结果:1.BmHEⅠ和BmHEⅡ基因启动子的克隆与分析:PCR克隆获得两种家蚕孵化酶基因的上游启动子序列,BmHEⅠp,长度为1350bp,BmHEⅡp,长度为1240bp。利用在线软件NNPP预测出BmHEⅠp,BmHEⅡp的核心启动子位置,BmHEⅠp上仅有一个核心启动子,BmHEⅡp上含有多个核心启动子;利用在线软件Alibaba预测比较了BmHEⅠ p与BmHEⅡp上可能存在的转录因子结合位点,结果显示BmHEⅠp上特有的转录因子结合位点有CREB、NF-1、c-Jun等13个,BmHEⅠIp上特有的转录因子结合位点有HNF-4α1、Pit-1a、TEF、MEB-1等17个。2.家蚕中肠、精巢和蚕卵胚胎核蛋白与Bm HE Ip和BmHEⅡp上的转录因子结合位点探针进行EMSA分析:首先采用细胞核蛋白质提取试剂盒抽提家蚕中肠、精巢和蚕卵胚胎核蛋白,中肠核蛋白浓度为4.73μg/μL、精巢核蛋白浓度为1.17μg/μL,蚕卵胚胎核蛋白浓度平均为4.92μg/μL;依据前人的研究,从所预测的BmHEⅠp和BmHEⅡp上的转录因子结合位点中,筛选出BmHEⅠp上的Oct-1、CRE-BP1转录因子结合位点,BmHEⅡp上的HNF-4α1、TBP转录因子结合位点,利用IR700染料对上述四个转录因子结合位点序列进行标记,将其作为探针与上述所抽提的核蛋白进行凝胶迁移阻滞分析(EMSA)。中肠核蛋白能与Oct-1、CRE-BP1探针特异性结合,精巢核蛋白能与HNF-4α1、TBP探针特异性结合,然而,精巢核蛋白不能与Oct-1、CRE-BP1探针结合,中肠核蛋白不能与HNF-4α1探针结合,推测在幼虫发育期,家蚕孵化酶基因表达的组织特异性可能与Oct-1、CRE-BP1、和HNF-4α1相关;催青第7~9天的蚕卵核蛋白能与TBP探针结合,催青第1~9天的蚕卵核蛋白能与HNF-4α1探针结合,推测在胚胎发育期,家蚕孵化酶基因的表达调控可能与TBP、HNF-4α1相关。3.EMSA阻滞条带的质谱分析:利用毛细管高效液相色谱法对上述EMSA的阻滞条带进行质谱鉴定,结果表明,未能直接证明凝胶阻滞条带中存在Oct-1、CRE-BP1、HNF-4α1和TBP转录因子成分,然而在凝胶阻滞条带中包含了其他转录因子成分。Apoptosis-related protein 1CAD、Cyclic AMP-regμLated protein和FancJ-like protein等能与CRE-BP1转录因子结合位点结合;14-3-3 protein zeta、actin-related 2/3 complex subunit 2和Beadex/dLMO protein等能与Oct-1转录因子结合位点结合;Fanconi anemia、complementation groupⅠ和HSP90等能够与HNF-4α1转录因子结合位点结合;Interleukin enhancer binding factor isoform 1、p53和translation initiation factor 2 gamma subunit等能与TBP转录因子结合位点结合,表明家蚕孵化酶基因表达的组织特异性不仅可能与Oct-1、CRE-BP1、HNF-4α1、TBP相关,还可能与上述转录因子相关。上述初步结果为进一步阐明家蚕孵化酶基因表达的调控途径提供了基础信息。(本文来源于《江苏科技大学》期刊2017-04-25）
陈加佳,唐顺明,刘龙山,沈兴家[6]（2016）在《家蚕孵化酶基因(BmHE和BmHEⅡ)启动子特性与EMSA初步分析》一文中研究指出本课题组业已报道了两种家蚕孵化酶基因,BmHE和BmHEⅡ,两名都参与了家蚕孵化过程。BmHEⅡ基因转录本相对表达量随着胚胎发育而上升并在孵化时达到顶峰,随后逐渐下降,其表达时相与孵化进程相一致。而在幼虫期两者表达具有组织特异性,BmHE与BmHEⅡ分别在中肠和精巢组织表达,推测具有消化功能和参与精子发生相关功能。本文利用Transfac分析软件预测两种家蚕孵化酶基因BmHE和BmHEⅡ的启动子序列中可能包含的顺式作用元件,采用抽提缓冲液分别抽提家蚕中肠核蛋白、精巢核蛋白,标记BmHE和BmHEⅡ启动子上特异性顺式作用元件进行凝胶迁移阻滞分析。家蚕BmHE启动子分析含有Oct-1、CRE-BP1、delta fa等特异元件,BmHEⅡ启动子分析含有TBP、HNF-4alphal、Hb等特异元件;抽提获得理想的中肠核蛋白和精巢核蛋白,中肠核蛋白可以与预测的0ct-1、CRE-BP1元件序列特异地结合,精巢核蛋白可以与预测的TBP、HNF-4alpha1元件序列特异地结合。该结果暗示家蚕孵化酶基因在幼虫期转录特性可能与Oct-1、CRE-BP1、TBP、HNF-4alpha1元件相关,这为进一步阐明家蚕孵化酶基因转录调控提供基础信息。(本文来源于《全国农业生物化学与分子生物学第十五届学术研讨会会议文集》期刊2016-09-01）
查艳[7]（2016）在《桑螟孵化酶基因特性分析与基于昆虫HE结构的进化研究》一文中研究指出桑螟属鳞翅目螟蛾科,是桑树的主要害虫之一。本文以桑螟(Diaphania pyloalis)为研究对象,通过RACE技术克隆获得桑螟孵化酶基因(Diaphania pyloalis hatching enzyme,DpyHE)全长cDNA序列。DpyHEcDNA序列全长983bp,其中包含21bp的5’UTR、44bp的3’UTR和一段918bp的完整开放阅读框,编码305个氨基酸,其中N端有16个氨基酸为信号肽序列,C端成熟酶区由222个氨基酸组成。同源性分析显示DpyHE与鳞翅目其他昆虫孵化酶蛋白功能区序列相似性分别为70.9%至76%,与柞蚕同源性最高。DpyHE氨基酸序列Pro90至Ser240之间具有一个锌依赖性金属蛋白酶结构域。用同源建模的方法以虾红素蛋白酶Astacin为模板预测DpyHE蛋白的叁维结构,结果显示DpyHE与Astacin叁维结构相似,表明桑螟孵化酶具有与虾红素蛋白酶相似的蛋白酶功能区和活性中心。另外,我们将DpyHE的成熟酶序列、去信号肽序列、ORF序列对应的基因序列克隆到原核表达系统中进行蛋白表达,Western Blot验证其获得表达,这为进一步进行桑螟孵化酶活性分析提供基础。最近基于鱼类孵化酶基因及其内含子缺失角度探讨了进化分析,获得了有意义的结果。本课题组已发现小菜蛾孵化酶基因仅为单外显子,这与家蚕孵化酶基因的多外显子基因结构存在差异。因此本文调查了代表性昆虫的孵化酶同源序列的基因结构与其保守区对应的内含子,分析昆虫纲孵化酶基因内含子缺失的状态及相互间的亲缘关系。我们选择基因组数据已发表并具有完整孵化酶成熟酶同源序列的6种鳞翅目昆虫和2种双翅目昆虫进行调查,结果显示5种鳞翅目昆虫孵化酶成熟酶同源序列为6-外显子-5-内含子结构,2种双翅目昆虫均为3-外显子-2-内含子结构,而鳞翅目小菜蛾为单外显子,这可能与硬骨鱼孵化酶基因HCE类似,存在内含子丢失的现象。为进一步扩大调查样本,我们调查18种基因组已发表的昆虫孵化酶同源序列保守区,发现其各自对应基因组所包含内含子数分为0和1两类别;所调查昆虫物种进化途径中可能存在内含子缺失现象;推测存在内含子缺失的节点与根据分子进化系统分析获得的物种分类分支点相一致。上述初步结果表明昆虫孵化酶基因结构的内含子缺失可作为一个候选基因来研究昆虫进化关系。(本文来源于《江苏科技大学》期刊2016-04-25）
李浩然,蒋石容,欧仁建,郭微微,杨先乐[8]（2015）在《鱼卵孵化酶在黄颡鱼鱼卵中的免疫组织化学定位和分布》一文中研究指出孵化酶存在于各种水生动物的胚胎中,会影响水生生物胚胎发育,是造成鱼类人工繁殖过程中早脱膜现象的重要因素之一。本研究以黄颡鱼鱼卵为研究对象,采用免疫组织化学方法对不同孵化时间点的孵化酶进行定位分布研究,探讨孵化酶在黄颡鱼鱼卵中的时空表达规律。结果表明:在黄颡鱼鱼卵中,孵化酶主要分布在鱼卵外胚层及卵膜内层上;在鱼卵孵化的各个时期均有孵化酶存在,孵化酶在各时间点的相对表达量没有明显差异。研究结果为阐释孵化酶在鱼卵孵化过程中的作用奠定了基础。(本文来源于《四川动物》期刊2015年03期）
贺华[9]（2015）在《蓖麻蚕孵化酶基因的克隆及其转基因载体构建》一文中研究指出蓖麻蚕(Philosamia cynthia ricini,eri-silkworm)是室内饲养的重要经济昆虫,以蓖麻叶为主要饲料,属于鳞翅目大蚕蛾科。包括家蚕、柞蚕、野蚕、桑蟥及小菜蛾在内几种鳞翅目昆虫孵化酶基因cDNA业已克隆报道,本文我们对蓖麻蚕孵化酶基因进行研究。根据已报道鳞翅目昆虫孵化酶的基因保守序列,我们设计合成兼并性引物,以蓖麻蚕转青卵cDNA为模版,克隆获得部分蓖麻蚕孵化酶基因(Philosamia Cynthia ricini hatching enzyme,PcrHE)序列,然后通过RACE-PCR和序列拼接获得蓖麻蚕孵化酶基因全长序列。PcrHE全长cDNA为962bp,其中包含3’UTR、5’UTR和885bp的开放阅读框,共编码294个氨基酸,N端16个氨基酸残基为信号肽序列。序列比对的同源性分析显示PcrHE与ApHEL,BmandHE,BmHE,RmHE,PxHE,BmHEⅡ,CuefHCE,DmHEHS,MLCE,XHE,EHE12,ZHCE1,MHCE23,TuHE,Aatacin和QHE的蛋白功能区序列相似性分别为92.3%,84.2%,83.3%,82.4%,79.5%,76.1%,44.7%,43.6%,33.9%,33.7%,32.3%,32.3%,32.1%,31.7%,31.4%和30.8%,根据进化树分析显示蓖麻蚕与柞蚕的亲缘关系最近。根据同源建模的方法对PcrHE进行了叁维结构的预测,显示其与蝲蛄金属蛋白酶的叁维结构相似,利用PROCHECK对所建蛋白叁维结构进行了评价,模拟得到的PcrHE蛋白叁维结构有90.2%位于合理区域内,理论上表明蛋白叁维结构是可靠的。通过RT-PCR的方法我们发现,在蓖麻蚕卵胚胎发育期不同阶段中,可以在胚胎发育早期检测到PcrHE转录本,维持在较低水平,孵化时达到最高值,表明PcrHE可能与孵化过程相关。另外,PcrHE转录本可在幼虫的中肠和精巢中检测到,推测PcrHE可能还有食物消化、精子发生等其它生物学功能。我们将PcrHE的成熟酶序列、去信号肽序列、ORF序列对应的基因序列分别克隆到原核表达系统pET28a中进行蛋白原核表达,SDS-PAGE电泳检测蛋白的表达,并用Western Blot进行验证。最后我们克隆了家蚕孵化酶基因启动子(BmHEⅠp,BmHEⅡp),由其驱动蓖麻蚕孵化酶基因,分别构建了转基因重组质粒pSL-3XP3-EGFP/BmHEⅠp-PcrHE,pSL-3XP3-EGFP/BmHEⅡp-PcrHE,并尝试将其用显微注射方法导入到家蚕卵中,以期在个体水平验证蓖麻蚕孵化酶的功能。这些研究结果为阐明蓖麻蚕卵孵化的分子机理提供分子依据,为其它鳞翅目昆虫孵化酶研究提供借鉴,为提高鳞翅目昆虫和转基因家蚕的孵化率提供依据。(本文来源于《江苏科技大学》期刊2015-04-23）
李浩然,蒋石容,欧仁建,郭微微,杨先乐[10]（2014）在《鱼卵孵化酶(HCE)在黄颡鱼鱼卵中的免疫组织化学定位和分布》一文中研究指出孵化酶存在于各种水生动物的的胚胎中,会影响水生生物胚胎发育,是造成鱼类人工繁殖过程中早脱膜现象的重要因素之一。以黄颡鱼鱼卵为研究对象,采用免疫组织化学方法对不同孵化时间点的孵化酶进行定位分布研究,探讨孵化酶在黄颡鱼鱼卵中的时空分布规律。结果表明:在黄颡鱼鱼卵中,孵化酶主要分布在鱼卵外胚层及卵膜内层上;在鱼卵孵化的各个时期均有孵化酶存在,孵化酶在各时间点的相对表达量没有明显差异。研究为孵化酶在鱼卵孵化过程中作用机理的研究奠定了理论基础。(本文来源于《2014年中国水产学会学术年会论文摘要集》期刊2014-10-29）
孵化酶论文开题报告
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
孵化酶(Hatching Enzyme,HE)是动物胚胎孵化过程中起消化卵壳或卵膜作用的一类蛋白酶。目前,本课题组已报道家蚕孵化酶基因(BmHE I和BmHE II),两基因转录本均在家蚕胚胎发育后期高量表达,在孵化前期表达量达到最高峰。此外,BmHE I在幼虫期的中肠组织中特异性表达,BmHE II在五龄幼虫期至蛾期的精巢组织中特异性表达。为探索两家蚕孵化酶基因的组织特异性表达调控,本研究对两种家蚕孵化酶基因启动子进行功能分析,构建均一化全长cDNA文库,利用酵母单杂交的方法对其结合启动子的转录因子进行初步筛选。本研究主要获得以下结果:1.体外分析家蚕孵化酶基因I启动子活性:克隆BmHE I基因5’端依次截短的启动子片段分别插入到pGL3.0-Basic载体中构建报告载体,与pRL-CMV内参载体共同转染家蚕BmN细胞。结果表明:在BmN细胞内,BmHE I基因上游1.3kb的启动子能驱萤火虫荧光素酶的表达,但总体活性并不高,基因转录起始位点上游-40至转录起始位点为核心启动子区,删除-97~-40bp区域后其启动子活性明显增加,说明在该区域可能存在转录抑制因子结合位点。2.体内分析家蚕孵化酶基因启动子活性:构建pFBDLuc-P10RLuc双荧光素酶表达转移载体,分别由不同长度的BmHE I和BmHE II启动子片段驱动萤火虫荧光素酶(Luc)作为报告基因,由杆状病毒p10启动子驱动的海肾荧光素酶(Rluc)作为内参基因。通过Bac-to-Bac表达系统制备重组杆状病毒,分别注射五龄起蚕,测定中肠和精巢组织中各不同长度启动子片段的荧光素酶活性。结果表明:在BmHE I启动子中,-886~-509bp之间存在重要的组织特异性转录因子结合位点。在BmHE II启动子中,-1226~-819bp之间存在正调控转录因子结合位点。3.家蚕中肠和精巢组织全长均一化表达cDNA文库的构建:利用DSN酶与SMART技术构建家蚕五龄第3天中肠和精巢组织全长均一化cDNA文库,进一步将均一化文库插入酵母表达载体pGADT7-Sfi上,转化进大肠杆菌进行质粒扩增,并提取质粒。结果表明:中肠组织的初级文库的库容分别为1.9×10~6 cfu,表达文库的平均插入长度大于1kb,重组率为100%,冗余率为3%;精巢组织的初级文库库容为1.8×10~6 cfu,平均插入长度大于1kb,重组率为100%,冗余率为0%。两均一化表达文库质量合格,提取两文库质粒,分别得到质量良好的文库质粒总量各4mg。4.构建酵母诱饵菌株:将BmHE I启动子-543~-90bp(Ip-A)和-990~-486bp(Ip-B)的片段以及合成并叁次串联重复含有HNF-1、GATA-1两个预测元件的(Ip-C)DNA片段作为诱饵片段;将BmHE II启动子扩增-455~-83bp区域(IIp-A)、-866~-398bp(IIp-B)的启动子片段以及合成含有WT1、PEA3、Ftz叁个预测元件并叁次串联重复的(IIp-C)DNA片段作为诱饵片段。成功构建了含BmHE I启动子片段或元件命名分别为Y1HGold[Ip-A-AbAi]、Y1HGold[Ip-B-AbAi]、Y1HGold[Ip-C-AbAi]的3个诱饵酵母菌株以及含BmHE II启动子片段或元件命名分别为Y1HGold[IIp-A-AbAi]、Y1HGold[IIp-B-AbAi]、Y1HGold[IIp-C-AbAi]的3个诱饵酵母菌株。5.利用酵母单杂交方法初步筛选孵化酶基因的转录因子:选取Y1HGold[Ip-B-AbAi]菌株进行中肠cDNA文库筛选,初步筛选出5个可能的转录因子,分别为aspartyl/asparaginyl beta-hydroxylase、leucine-rich repeat-containing protein 70、TBC1domain family member 16、KRR1 small subunit processome component homolog和regucalcin。选取Y1HGold[IIp-B-AbAi]菌株进行精巢cDNA文库筛选,初步筛选出7个可能的转录因子,分别为period(Per)、mimitin,mitochondrial、39S ribosomal protein L51、ribosomal protein L8、UPF0545 protein C22orf39 homolog、zinc finger CCCH domain-containing protein、nucleoporin NUP53。综上所述,本实验通过对家蚕孵化酶基因启动子的研究,找到了一些重要的与组织特异性调控相关的区域,构建家蚕中肠和精巢组织cDNA均一化表达文库,利用酵母单杂交系统初步筛选出与家蚕孵化酶基因启动子相结合的可能的转录因子。研究结果为进一步研究家蚕孵化酶基因的转录表达调控奠定基础。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
孵化酶论文参考文献
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