细菌群感效应抑制剂的筛选与分离及QSI作用机理初探

论文摘要

由表皮葡萄球菌引起的疾病多数为反复发作难以治愈,究其原因是因为表皮葡萄球菌易形成生物被膜(Biofilm,BF)。细菌在BF状态下比浮游状态下耐抗生素的能力能提高10~1000倍,而形成BF的细菌对抗生素更易产生耐药性。表皮葡萄球菌BF的形成是由群感效应(Quorum Sensing,QS)调控的,QS能直接控制BF的形成或解离。而群感效应抑制剂(Quorum Sensing inhibitors,QSI)是在不抑菌的情况下,抑制QS的产生,因此微生物不易对QSI产生耐药性,已经成为当今抗菌药物研发的趋势。在前期研究中,发现用不同的培养基发酵放线菌,其抑制表皮葡萄球菌BF形成和紫色素杆菌QS的效果差别很大。在前期工作中,发现灰色链霉菌TRM10325抑制紫色素杆菌QS和表皮葡萄球菌BF形成都有较好的效果,因此选取17种合成培养基、26种天然培养基发酵TRM10325,采用微孔板半定量法检测其对紫色素杆菌QS以及表皮葡萄球菌BF形成的抑制作用。实验结果发现,不同配方的培养基对放线菌TRM10325抑制QS活性的影响也不相同,说明成分不同的培养基,明显影响微生物不同次级代谢产物的产生。为筛选最优发酵培养基提供实验依据。从新疆丰富的生物资源中,采用微孔板半定量法筛选放线菌来源与植物来源的抑制表皮葡萄球菌BF形成和紫色素杆菌QS的抑制剂。筛选了170株来自新疆南疆地区不同分离来源的放线菌和15种新疆南疆地区植物。发现灰色链霉菌TRM10325和昆仑雪菊,在不抑菌的情况下,对紫色素杆菌ATCC12472 QS和表皮葡萄球菌ATCC35984 BF形成都具有较好的抑制作用,因此本课题拟从TRM10325的发酵液和昆仑雪菊中筛选和分离QSI,为新型抗菌药物研发提供实验依据。采用大孔树脂柱层析、高效液相色谱等多种分离技术,并综合IR、UV、1D&2DNMR等波谱学实验数据的解析,分离鉴定放线菌源与植物源的QSI。从昆仑雪菊中分离得到8个具有QSI作用的单体化合物,其中有7个为黄酮类物质,1个烯炔类化合物。对这8个化合物抑制表皮葡萄球菌BF形成和紫色素杆菌QS的活性进行了检测,结果表明这8个化合物不仅对表皮葡萄球菌ATCC35984BF有明显的抑制作用,更对紫色素杆菌ATCC12472产色素有更明显的抑制效果。选定放线菌来源的放线菌素D和植物来源的槲皮素两个单体活性化合物,对表皮葡萄球菌ATCC35984 BF形成的抑制机理进行初步研究。发现放线菌素D和槲皮素能显著降低表皮葡萄球菌细胞表面疏水性,在BF形成的初始粘附期就发挥明显的抑制效果,比聚集期的抑制效果好。其次放线菌素D和槲皮素还能改变表皮葡萄球菌胞外多糖的种类和含量,从而降低BF形成能力。放线菌素D和槲皮素对表皮葡萄球菌ATCC35984的胞外蛋白、胞外DNA无降解作用。本研究目的在于充分利用新疆丰富的生物资源,从中筛选QSI,为研发新型抗菌药物提供实验依据。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第1章 文献综述
•   1.1 QS与细菌耐药性的研究现状
•   1.2 QSI研究现状
•     1.2.1 群感效应抑制剂的来源
•     1.2.2 QSI抑制机理研究进展
•   1.3 本论文的设计思路
•     1.3.1 研究目的及意义
•     1.3.2 技术路线
• 第2章 不同培养基对TRM10325抑制QS活性的影响
•   2.1 材料
•     2.1.1 实验菌株及培养基
•     2.1.2 主要仪器与试剂
•   2.2 方法
•     2.2.1 放线菌TRM10325菌株活化及发酵
•     2.2.2 放线菌TRM10325发酵液抑制紫色素杆菌ATCC12472 QS能力检测
•     2.2.3 紫色杆菌素定量方法
•     2.2.4 放线菌TRM10325发酵液抑制表皮葡萄球菌ATCC35984 BF形成能力检测
•   2.3 结果与分析
•     2.3.1 17 种合成培养基对放线菌TRM10325抑制QS的影响
•     2.3.2 26 种天然培养基对放线菌TRM10325抑制QS的影响
•   2.4 小结与讨论
• 第3章 新疆南疆地区放线菌源和植物源QSI的筛选
•   3.1 实验材料
•     3.1.1 实验菌株培养基及材料
•     3.1.2 实验仪器
•   3.2 实验方法
•     3.2.1 放线菌来源QSI的筛选
•     3.2.2 植物来源QSI的筛选
•   3.3 结果与分析
•     3.3.1 抑制紫色素杆菌ATCC12472 QS放线菌的筛选
•     3.3.2 菌株鉴定结果
•     3.3.3 抑制表皮葡萄球菌ATCC35984 BF形成放线菌的筛选
•     3.3.4 TRM10325发酵液蛋白酶活性检测结果
•     3.3.5 抑制紫色素杆菌ATCC12472 QS新疆南疆地区植物的筛选
•     3.3.6 抑制表皮葡萄球菌ATCC35984 BF形成新疆南疆地区植物的筛选
•   3.4 小结与讨论
• 第4章 QSI的分离鉴定与活性检测
•   4.1 实验材料
•     4.1.1 实验菌株培养基与材料
•     4.1.2 培养基及仪器耗材
•   4.2 实验方法
•     4.2.1 昆仑雪菊粗提物总黄酮含量测定
•     4.2.2 TRM10325 次生代谢产物和昆仑雪菊粗提物抑制QS活性部位确定
•     4.2.3 昆仑雪菊化学成分的分离与结构鉴定
•     4.2.4 昆仑雪菊单体化合物对QS的影响
•   4.3 结果与分析
•     4.3.1 昆仑雪菊粗提物总黄酮含量标曲测定
•     4.3.2 TRM10325 次生代谢产物和昆仑雪菊粗提物各段活性追踪
•     4.3.3 昆仑雪菊单体化合物结构鉴定
•     4.3.4 昆仑雪菊单体化合物对QS的影响结果
•   4.4 小结与讨论
• 第5章 放线菌素D与槲皮素抑制表皮葡萄球菌BF形成机理初探
•   5.1 材料与方法
•     5.1.1 实验菌株与材料
•     5.1.2 实验溶液及仪器
•     5.1.3 放线菌素D与槲皮素作用机理的初步研究
•   5.2 结果与分析
•     5.2.1 放线菌素D标品和TRM45540发酵液HPLC图比较
•     5.2.2 放线菌素D对表皮葡萄球菌ATCC35984 MIC、MBC值的测定
•     5.2.3 放线菌素D与槲皮素对表皮葡萄球菌ATCC35984 BF结构和形成的影响
•     5.2.4 放线菌素D与槲皮素对表皮葡萄球菌细胞表面疏水性的影响
•     5.2.5 放线菌素D与槲皮素对表皮葡萄球菌ATCC35984胞外蛋白的影响结果
•     5.2.6 放线菌素D与槲皮素对表皮葡萄球菌ATCC35984胞外DNA的影响结果
•     5.2.7 放线菌素D与槲皮素对表皮葡萄球菌ATCC35984胞外多糖的影响结果
•   5.3 小结与讨论
• 第6章 结论与展望
• 参考文献
• 致谢
• 作者简介
• 附录

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 穆永其

导师: 陈伟,曾红

关键词: 放线菌,昆仑雪菊,紫色素杆菌,生物膜形成,化合物分离鉴定

来源: 塔里木大学

年度: 2019

分类: 基础科学

专业: 生物学

单位: 塔里木大学

基金: 国家自然科学基金项目“新疆小花棘豆活性成分对奶牛乳腺炎性表皮葡萄球菌生物膜形成影响及其机制研究”教育部“新世纪优秀人才支持计划”新疆兵团博士资金专项“南疆地区奶牛隐性乳房炎与葡萄球菌生物膜形成关系研究”的部分研究成果(项目编号:31260026,NCET-11-10712009JC07)课题主持人:陈伟教授

分类号: Q939.9

总页数: 102

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