小鼠精原干细胞分离、纯化与去分化研究

论文摘要

精原干细胞（spermatogonial stem cells,SSCs）是哺乳动物体内唯一可以将遗传信息传递给下一代、功能单一的干细胞,体外分离培养SSCs为探索其生物学特性及其增殖、分化与去分化机制奠定了基础。SSCs在特定的体外培养条件下,即使无外源基因操作也可以重编程形成多能干细胞。多能干细胞不仅具有自我复制的能力,而且具有形成多种组织和细胞的能力,具有很大的潜在应用前景。诱导性多能干细胞（induced pluripotent stem cells,iPSCs）虽然在体内外可分化形成三胚层,但由于外源基因的插入使其应用受到制约。因此,SSCs更适用于人类临床及动物分子育种应用。本研究分为两部分,第一部分实验以小鼠作为动物模型,分离、纯化并体外培养小鼠精原干细胞（mouse spermatogonial stem cells,m SSCs）。采用机械分离法、两步酶消化法结合连续差速贴壁法成功分离、纯化得到来源于Oct4/GFP×CD1杂交品系F1代小鼠睾丸的mSSCs,并对体外培养的mSSCs进行鉴定分析。当细胞稳定生长时,通过观察细胞形态、碱性磷酸酶染色、免疫荧光染色、RT-PCR和RT-qPCR检测结果初步鉴定体外分离和培养的细胞满足mSSCs的标准,为第二部分实验提供实验材料。第二部分实验主要集中于用小分子化合物诱导mSSCs去分化形成多能干细胞。获得的细胞克隆能稳定生长时,在基因表达水平进行鉴定分析,比如Oct4、Sox2、Nanog和Rex1。细胞形态、GFP表达、碱性磷酸酶染色、免疫荧光染色、RT-PCR和RT-qPCR检测结果初步鉴定,mSSCs可以通过小分子化合物诱导液向多能性方向转化,并形成具有多能干细胞特性的细胞。本研究既丰富了制备多能干细胞的方法,也为今后深入研究mSSCs重编程为多能干细胞的机制提供了基础实验材料,同时也为研究男性不育症提供了新的途径。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 缩略词表
• 第一章 文献综述
•   1.1 小鼠精原干细胞的研究进展
•   1.2 小鼠精原干细胞去分化形成多能干细胞的研究进展
•   1.3 小分子化合物诱导细胞重编程研究进展
•   1.4 本研究的目的与意义
• 第二章 小鼠精原干细胞的分离与纯化
•   2.1 实验材料
•     2.1.1 动物品系
•     2.1.2 主要试剂
•     2.1.3 主要仪器
•   2.2 实验方法
•     2.2.1 主要溶液的配制
•     2.2.2 制备饲养层细胞
•     2.2.3 小鼠精原干细胞体外分离培养
•     2.2.4 mSSCs的鉴定
•   2.3 实验结果
•     2.3.1 饲养层细胞形态
•     2.3.2 经过差速贴壁筛选后的mSSCs形态
•     2.3.3 mSSCs的形态
•     2.3.4 mSSCs碱性磷酸酶表达的检测结果
•     2.3.5 mSSCs免疫荧光染色结果
•     2.3.6 mSSCs标记基因的RT-qRCR检测结果
•   2.4 讨论
• 第三章 小鼠精原干细胞去分化为多能性干细胞
•   3.1 实验材料
•     3.1.1 主要试剂
•     3.1.2 主要仪器
•   3.2 实验方法
•     3.2.1 主要溶液的配制
•     3.2.2 诱导mSSCs去分化形成多能干细胞
•     3.2.3 g PS细胞的鉴定
•   3.3 实验结果
•     3.3.1 g PS细胞形态
•     3.3.2 g PS细胞GFP表达结果
•     3.3.3 g PS细胞碱性磷酸酶表达检测结果
•     3.3.4 g PS细胞免疫荧光染色结果
•     3.3.5 g PS细胞标记基因RT-qRCR检测
•   3.4 讨论
• 结论
• 参考文献
• 致谢

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 张晓娜

导师: 戴雁峰

关键词: 精原干细胞,分离,纯化,去分化,小鼠

来源: 内蒙古大学

年度: 2019

分类: 基础科学

专业: 生物学

单位: 内蒙古大学

基金: 国家自然科学基金项目(31272445,31360548),内蒙古自然科学基金项目(2017ZD04)

分类号: Q132.1

总页数: 59

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