宿主蛋白HSP70、ZBTB-38对日本乙型脑炎病毒增殖的影响

论文摘要

流行性乙型脑炎（JE）是日本乙型脑炎病毒（JEV）引起的一种重要的人兽共患病,猪是其中间放大宿主。JEV能通过多种途径感染宿主,我们前期研究也表明,JEV能在小鼠的肺脏复制并发生呼吸道传播,但是JEV导致呼吸道感染的分子机理尚不清楚。为此,本研究聚焦JEV与宿主呼吸道细胞的相互作用,探究JEV与猪肺泡巨噬细胞（PAM）互作蛋白并验证其对于JEV增殖的影响。本研究运用免疫共沉淀技术,首先筛选PAM细胞与JEV互作的宿主蛋白,并通过LC/MSMS质谱分析,确认成功筛选出宿主互作蛋白HSP70和ZBTB-38。然后,运用CRISPR/Cas9技术分别构建HSP70和ZBTB-38基因敲除细胞系,并通过DNA测序及间接免疫荧光检测其敲除效果,测序结果显示两基因的DNA序列均成功发生移码,间接免疫荧光结果显示均无特异性荧光出现,结果表明HSP70和ZBTB-38均被成功敲除。接下来,在基因敲除细胞系PAM.KO.HSP70和PAM.KO.ZBTB-38接种JEV后48h,JEV的mRNA水平分别下降了2.3倍和9倍,病毒蛋白表达水平分别下降了0.25倍和1倍;感染后72h,病毒粒子数量较对照组均有0.3倍的下降。最后,在PAM.KO.HSP70和PAM.KO.ZBTB-38细胞系中分别过表达HSP70和ZBTB-38基因并接种JEV,结果显示,JEV感染后48h,与对照组相比JEV的mRNA水平分别增加了0.9倍和1.5倍,病毒蛋白表达水平增加了8.5倍和0.5倍;感染后72h,病毒粒子数量也有提高。综上,本研究结果表明,PAM蛋白HSP70和ZBTB-38为JEV的互作蛋白,对JEV的增殖发挥正向调控作用。本研究结果将为JEV的致病机理研究,尤其是JEV感染导致的呼吸道传播,提供前期研究资料。

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 英文缩略词表
• 第一部分 文献综述
•   1 日本乙型脑炎病毒概述
•   2 黄病毒与宿主细胞互作蛋白的概述
•     2.1 黄病毒细胞受体
•       2.1.1 DC-SIGN和 L-SIGN
•       2.1.2 甘露醇受体
•       2.1.3 CLEC5A
•       2.1.4 TIM受体
•     2.2 热休克蛋白
•     2.3 锌指蛋白
•   3 蛋白相互作用方法的概述
•     3.1 免疫共沉淀
•     3.2 酵母双杂交系统
•     3.3 GST pull-down
•   4 CRISPR/Cas9 基因编辑技术的概述
•     4.1 CRISPR/Cas9 基因编辑技术组成
•     4.2 CRISPR/Cas9 基因编辑技术作用机制
•     4.3 CRISPR/Cas9 基因编辑技术的应用
•       4.3.1 基因编辑技术CRISPR/Cas9 对体细胞基因编辑的应用
•       4.3.2 基因编辑技术CRISPR/Cas9 在功能基因组筛选中的应用
•       4.3.3 基因编辑技术CRISPR/Cas9 在疾病治疗的应用
•   5 本研究目的与意义
• 第二部分 试验研究
•   第一章 日本乙型脑炎病毒与宿主细胞猪肺泡巨噬细胞互作蛋白的筛选
•     1 材料
•       1.1 试验材料
•     1.1.1 试验毒株
•     1.1.2 细胞系与载体
•     1.1.3 主要试剂
•     1.1.4 主要溶液配制
•     2 方法
•       2.1 JEV感染PAM细胞
•       2.2 PAM细胞膜蛋白提取
•       2.3 BCA蛋白定量
•       2.4 免疫共沉淀
•       2.5 LC-MS/MS分析及数据库查询
•       2.6 CRISPR/Cas9 敲除HSP70、ZBTB-38 基因
•     2.6.1 sgRNA设计
•     2.6.2 PX459 载体线性化
•     2.6.3 双链sgRNA的合成
•     2.6.4 sgRNA二聚体与PX459 线性载体连接
•     2.6.5 重组质粒的转化
•     2.6.6 重组质粒的PCR鉴定
•       2.7 敲除HSP70、ZBTB-38 基因PAM细胞系的构建
•     2.7.1 PAM细胞嘌呤霉素耐受性试验
•     2.7.2 质粒转染
•     2.7.3 细胞筛选
•     2.7.4 基因敲除PAM细胞DNA测序
•     2.7.5 基因敲除PAM细胞的间接免疫荧光（IFA）检测
•     3 结果
•       3.1 JEV感染PAM细胞
•       3.2 免疫共沉淀结果
•       3.3 LC-MS/MS质谱分析
•       3.4 重组质粒PCR鉴定
•       3.5 PAM细胞嘌呤霉素耐受性试验
•       3.6 HSP70、ZBTB-38 基因敲除细胞稳定株的基因组DNA测序
•       3.7 基因敲除PAM细胞的间接免疫荧光（IFA）结果
•     4 讨论
•     5 小结
•   第二章 宿主蛋白HSP70、ZBTB-38 对乙脑病毒的增殖影响
•     1 材料
•       1.1 试验材料
•     1.1.1 细胞系与载体
•     1.1.2 主要试剂
•       1.2 主要仪器
•     2 方法
•       2.1 敲除HSP70、ZBTB-38 基因对乙脑病毒增殖的影响验证
•     2.1.1 荧光定量PCR检测JEV增殖量
•     2.1.2 Western-blot检测病毒蛋白表达水平
•     2.1.3 噬斑实验检测病毒的滴度
•       2.2 过表达HSP70、ZBTB-38 基因对乙脑病毒增殖的影响验证
•     2.2.1 引物设计
•     2.2.2 基因扩增及纯化
•     2.2.3 真核表达载体的构建
•     2.2.4 真核表达载体的鉴定
•     2.2.5 细胞转染
•     2.2.6 荧光定量PCR检测JEV增殖量
•     2.2.7 Western-blot检测病毒蛋白表达水平
•     2.2.8 噬斑实验检测病毒的滴度
•     2.2.9 统计学方法
•     3 结果
•       3.1 荧光定量PCR检测基因敲除对JEV增殖影响的结果
•       3.2 Western blot检测基因敲除对JEV增殖影响的结果
•       3.3 噬斑实验检测基因敲除对病毒滴度影响的结果
•       3.4 HSP70、ZBTB38 基因扩增
•       3.5 真核表达载体酶切及测序鉴定
•       3.6 真核重组质粒细胞转染结果
•       3.7 荧光定量PCR检测基因过表达对JEV增殖影响的结果
•       3.8 Western blot检测基因过表达对JEV增殖影响的结果
•       3.9 噬斑实验检测基因过表达对病毒滴度影响的结果
•     4 讨论
•     5 小结
• 结论
• 参考文献
• 致谢
• 作者简历

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 柴春霞

导师: 伍锐

关键词: 病毒增殖

来源: 四川农业大学

年度: 2019

分类: 基础科学,农业科技

专业: 生物学,畜牧与动物医学

单位: 四川农业大学

分类号: S852.65

DOI: 10.27345/d.cnki.gsnyu.2019.000605

总页数: 62

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