一、血清稀释度对ELISA法检测结核病人血清抗体结果的影响（论文文献综述）
王冰清[1]（2021）在《江苏睢宁县2018-2020年奶牛布鲁氏菌病、结核病流行病学调查及综合防控技术示范》文中研究表明布鲁氏菌病（可简称为“布病”）和结核病对奶牛健康造成极大威胁,布病主要侵害生殖系统,引起母畜流产、不孕。结核病能引起奶牛咳嗽、消瘦,病变部位形成结核结节。它们属于人兽共患病,对人病患者影响非常大。加强“两病”监测及防控在奶牛饲养和公共卫生上具有重要意义。为了解江苏睢宁县奶牛布病和结核病的流行情况,本研究于2018-2020年在睢宁县境内选取7家规模奶牛场的部分奶牛进行试验研究,采用虎红平板凝集试验、试管凝集试验和竞争酶联免疫吸附试验对6963份样品进行布病流行病学调查;采用结核杆菌PPD皮内变态反应试验和μ-干扰素体外释放试验对1971份样品进行结核病流行病学调查。同时参与一种布病新型快速检测方法（正在申报专利）对比试验,助力更加经济实用的布病检测方法的研发。试验结果显示,2018-2020年睢宁县奶牛布病阳性率呈下降趋势,但形势依然严峻。存栏500头以下的奶牛场布病阳性率最高,为8.36%（51/610）,存栏500-1000头的奶牛场布病阳性率居中,为0.93%（6/643）;存栏1000头以上的奶牛场布病阳性率最低,为0.11%（6/5665）。3种血清学检测方法检出的布病阳性率对比,虎红平板凝集试验（13.38%,21/157）>竞争酶联免疫吸附试验（11.67%,18/157）>试管凝集试验（10.19%,16/157）。2018-2020年睢宁县奶牛结核病感染率持续偏高,已经威胁到奶牛业发展及公共卫生安全;只有存栏1000头以上的牛场结核病阳性率保持为0（0/1132）,其他规模的奶牛场阳性率普遍较高;2种检测方法检出的结核病阳性率对比,μ-干扰素体外释放试验（26.67%,16/60）>PPD皮内变态反应试验（20.00%,12/60）。通过竞争酶联免疫吸附试验与新型快速检测方法的对比试验,发现新型快速检测方法方便快捷,特异性和敏感性高,对于基层动物检疫部门和养殖场来说非常有益。2017年对D牛场开展奶牛“两病”监测,121头份样品中检测出23头奶牛患有结核病,25头奶牛患有布病。为帮助该场更好地继续养殖工作,维护睢宁县奶牛业健康发展,2018年起对D牛场开展奶牛养殖场布病、结核病净化技术的研究与示范。经过环境改造、科学饲养、精细化管理等全方位的净化措施,2020年该场奶牛“两病”阳性率为0（0/126）,取得显着成效。通过应用试验优化发酵床养殖技术,减少病原菌滋生,通过奶牛场智能监管系统能预警奶牛健康状况,对于奶牛“两病”防控有很大帮助。根据示范成效深化综合防控措施,突出了改善饲养方式和加强智能监管的重要性。
刘静[2]（2021）在《新疆汉族人群结核分枝杆菌免疫优势Th表位的筛选与鉴定》文中研究指明目的:筛选与鉴定新疆汉族人群结核分枝杆菌免疫优势Th表位,并初步评估其免疫原性及免疫保护效果,继而为设计重组卡介苗菌株、研发以表位为基础的新型结核病疫苗及结核病特异性诊断试剂提供基础依据。方法:1.生物信息学软件预测。采用NCBI网站获取结核分枝杆菌抗原蛋白Rv3874,Rv0934,Rv3875,Rv3804c,Rv3878的氨基酸序列,用EXPASY软件分析其与人类蛋白质组的同源性。应用DNAStar、SYFPEITHI、RANKPEP、Net MHCⅡpan四种生物信息学软件进行联合预测新疆汉族人群结核分枝杆菌Th表位,确定本研究的预测Th表位肽。2.SWISS-MODEL软件对Rv3874,Rv0934,Rv3875,Rv3804c,Rv3878进行三级结构同源性建模。采用Py MOL软件对预测Th表位肽进行三级结构定位分析。3.采用Fmoc法合成预测Th表位肽。高效液相色谱（HPLC）对预测表位肽进行纯度分析,质谱（MS）对预测表位肽进行分子质量测定。4.CCK8法检测PBS组及40.0μg/m L、20.0μg/m L、10.0μg/m L、5.0μg/m L和2.5μg/m L五种不同浓度多肽组对淋巴细胞增殖水平的影响。探讨Th表位多肽刺激淋巴细胞的最佳工作浓度。5.采用CCK8法测定预测Th表位肽分别刺激外周血单个核细胞（PBMC）及CD4+T细胞的增殖情况,初步筛选出候选Th细胞表位肽。6.采用Brd U法测定候选Th细胞表位肽刺激CD4+T细胞增殖情况。7.候选Th细胞表位肽刺激PBMC后,流式细胞术进行CD4+T细胞增殖的表型分析。8.候选Th细胞表位肽刺激CD4+T细胞后,培养72 h,收集上清液,酶联免疫吸附测定（ELISA）方法检测细胞因子（IFN-γ,TNF-α,IL-2和IL-10）的水平。9.将候选Th细胞表位多肽包被酶标板,棋盘滴定法确定候选Th细胞表位肽作为包被抗原检测血清Ig G抗体最佳条件;间接ELISA法评价候选Th细胞表位多肽检测结核病的效能,筛选出具有诊断潜力的Th细胞表位多肽。结果:1.经生物信息学获得五条新疆汉族人群结核分枝杆菌预测Th表位肽,分别命名P39（Rv3874）,P50（Rv0934）,P40（Rv3875）,P185（Rv3804c）,P62（Rv3878）。2.利用SWISS-MODEL软件,得到五种抗原蛋白三级预测模型,其结果可靠,质量较好。使用Py MOL软件,结果显示P39、P50、P40、P185、P62均位于蛋白抗原结构的外部β片层和内部Loop区。3.P39、P50、P40、P185、P62的纯度分别为91.79%、96.27%、96.54%、92.61%、96.99%;分子质量测定值分别为1557.06、1575.30、1486.70、1410.80、1491.13。4.CCK8法确定Th细胞表位肽刺激淋巴细胞的最佳工作浓度为40μg/ml。5.CCK8法的初步筛选结果显示P39与P62能够刺激新疆汉族结核病患者的CD4+T细胞增殖,为候选Th细胞表位肽。6.Brd U法测定P39、P62及混合肽P39+P62刺激新疆汉族结核病患者的CD4+T细胞增殖活化情况,结果显示PBS组与P39组、P62组及混合肽P39+P62组比较差异均具有显着性（P<0.001）。7.流式细胞术进行P39、P62及混合肽P39+P62刺激PBMC后CD4+T细胞增殖的表型分析。结果显示P39、P62及混合肽P39+P62组与PBS对照组比较差异具有显着性（P<0.001）。8.ELISA结果显示P39、P62及混合肽P39+P62组CD4+T细胞上清中的IFN-γ、TNF-α、IL-2水平高于PBS组（P<0.001）,混合肽P39+P62组的IL-10水平低于PBS组（P<0.001）。9.P39、P62及混合肽P39+P62的最佳包被浓度分别为10μg/ml、0.25μg/ml、10μg/ml。一抗血清的最佳稀释度分别为1:500、1:100、1:50。P39敏感性为75%,特异性为67.71%,受试者工作特征曲线下面积（AUC）为0.844。P62敏感性为91.66%,特异性为46.87%,AUC为0.649。混合肽P39+P62的敏感性为95.83%,特异性为97.91%,AUC为0.793。结论:1.本研究通过生物信息学对Rv3874、Rv0934、Rv3875、Rv3804c和Rv3878进行了多参数的综合预测分析,最后共筛选出五条Th预测表位肽,即P39、P50、P40、P185、P62。合成后均为高纯度表位肽。2.本研究确定了Th细胞表位肽的最佳工作浓度为40μg/ml,P39和P62是候选的新疆汉族人群结核分枝杆菌免疫优势Th表位多肽。3.本研究发现P39、P62及混合肽P39+P62均具有良好的免疫原性及免疫保护性,在检测外周血结核Ig G抗体中联合运用P39、P62诊断价值升高,可为加快研制结核病特异性诊断试剂、设计重组卡介苗菌株及研发新型结核病疫苗提供依据。
章美娟[3]（2021）在《类鼻疽菌Hcp1及外膜多糖的制备与免疫学性质研究》文中提出类鼻疽伯克霍尔德菌（Burkholderia pseudomallei）简称类鼻疽菌,属兼性胞内革兰氏阴性菌,主要存在于水源和土壤中,可通过多种途径（如呼吸道、消化道等）感染人和动物,引起一种称为类鼻疽（Melioidosis）的人兽共患病。类鼻疽的临床症状多样,包括难治性肺炎、坏疽以及致死性败血症等,治疗周期长,费用高,且存在较高的复发率。鉴于类鼻疽菌极易传播、致死率高、耐药性强,且目前尚无有效的疫苗,已被WHO列为B类生物恐怖剂,严重危害人类健康。调查结果显示在全球范围内,类鼻疽病的诊断严重不足。目前,针对类鼻疽菌的实验室诊断方法（如细菌学培养、分子生物学方法和蛋白组学方法等）均存在一定的局限性,且没有商业化、可靠的类鼻疽菌快速诊断方法应用于临床,因此,建立一种简便快速的诊断方法迫在眉睫。ELISA是一种标准的血清学检测方法,也是进一步发展快速检测方法的基础。已有研究报道显示类鼻疽菌溶血素共调节蛋白1（hemolysin coregulated protein 1,Hcp1）的表达水平在其感染宿主的过程中会显着升高,并且能够与类鼻疽患者血清发生强烈的抗原抗体反应,这提示我们该蛋白可诱导机体产生特异性抗体,具有作为血清学诊断抗原的潜在应用价值。基于此,本研究采用DNA重组技术,通过原核表达的方式获得了分子量大小为18 k Da左右的高纯度重组Hcp1（recombinant Hcp1,r Hcp1）蛋白。进一步,我们对r Hcp1蛋白的免疫学性质进行了初步的研究:首先以r Hcp1蛋白免疫小鼠,利用间接ELISA实验检测抗血清效价,结果显示r Hcp1蛋白表现出较强的免疫原性,刺激动物产生的抗体效价可达1:512 000。接着利用免疫印迹实验、免疫荧光实验对r Hcp1蛋白及其抗血清的特异性进行研究,结果显示r Hcp1蛋白能够与类鼻疽病人的血清发生特异性结合,而与来自疫区阴性血清（未感染类鼻疽菌体检者的血清）不发生结合,二者差异极显着;r Hcp1抗血清仅与类鼻疽不同临床菌株发生特异性结合反应,而与其他病原菌不发生反应,说明r Hcp1蛋白具有较强的特异性。据此,我们初步认为r Hcp1可以作为类鼻疽血清学诊断的候选抗原靶标。类鼻疽菌表面含有丰富的多糖,包括脂多糖（lipopolysaccharides,LPS）、荚膜多糖（capsular polysaccharides,CPS）和胞外多糖（exopolysaccharides,EPS）等,这些外膜多糖作为重要的毒力因子,在类鼻疽菌的致病机制和免疫调节中发挥着重要的作用,具有作为诊断抗原和疫苗候选抗原的潜能。由于类鼻疽菌可以表达多种LPS和CPS,而截至目前,尚无关于我国类鼻疽菌临床分离株表面多糖的相关报道,对其外膜多糖抗原类型及其生物学功能尚不清楚。基于此,本研究对不同临床菌株进行了外膜多糖的纯化、结构表征和免疫原性研究。首先采用分步提取的方式获得了不同类鼻疽菌临床菌株的胞外多糖,并利用离子交换层析和分子筛层析进行分离纯化,高效凝胶渗透色谱鉴定结果显示纯化后的三种抗原成分BPC004-BPPI-b1、BPC006-BPPI-b1和BPC010-BPPI-b1组成相对均一,分子量大小均分别为931 k Da,640 k Da和546 k Da。进而利用GC-MS、甲基化分析、FT-IR和1D/2D NMR进行精细结构的表征,结果显示BPC004-BPPI-b1的结构为[3)-2OAc-β-D-6-deoxy-Hepp-（1→3）-β-D-6-deoxy-Hepp-（1→]重复单元组成的线性多糖链;BPC006-BPPI-b1主要由[3-（a-D-Manp-1→3-a-D-Manp）4-2Me-a-L-6d Talp-1→]构成;BPC010-BPPI-b1的结构与BPC006-BPPI-b1基本相同。进一步,对这三种多糖抗原的免疫学性质以及抗原结构对其免疫活性的影响进行了初步研究:首先采用间接ELISA法对多糖抗原的免疫原性和免疫反应性进行了研究,结果显示三种糖抗原均具有较好的免疫原性,且能够与类鼻疽病人的血清发生特异性结合反应,而与疫区阴性血清不发生结合反应。接着采用间接ELISA法对多糖抗原的抗血清与不同临床菌株的交叉反应情况进行了研究,结果显示抗血清可与本研究中所选取的80%临床菌株发生交叉反应,推测本文所表征的[3）-2OAc-β-D-6-deoxy-Hepp-（1→3）-β-D-6-deoxy-Hepp-(1→]和[3-（a-D-Manp-1→3-a-D-Manp）4-2Me-a-L-6d Talp-1→]两种抗原可能在类鼻疽菌的血清学诊断和疫苗开发方面都具有较大的应用价值。最后利用FT-IR、免疫印迹及竞争性ELISA法对多糖抗原表位上的乙酰化修饰基团对其免疫原性的影响进行了研究,结果显示抗原表位上的乙酰化修饰基团对其免疫活性十分重要,脱去乙酰基的抗原丧失了与抗体的结合能力。综上所述,本文的研究结果将为类鼻疽菌诊断抗原和疫苗候选抗原的筛选提供新的理论依据和数据支撑。
尹峥[4]（2021）在《基于PLD蛋白的伪结核棒状杆菌抗体间接ELISA检测方法的建立及初步应用》文中认为伪结核棒状杆菌（Corynebacterium pseudotuberculosis,Cp）感染引起羊干酪性淋巴结炎（Caseous lymphadenitis,CLA）又称羊伪结核（Goat pseudotuberculosis）,绵羊和山羊发病时浅表淋巴结及肝脏、肺脏等多个脏器会出现脓肿和干酪样坏死,严重制约我国羊养殖业的健康发展。针对此病,目前还没有有效的治疗与防控措施,并且国内外现存疫苗免疫效果不佳,不能对动物起到良好的保护作用,对该病也没有很好的诊断方法。因此,迫切需要建立检测伪结核棒状杆菌抗体的检测方法应用于临床,以及时筛查感染羊,达到疾病净化目的。本试验先进行了伪结核棒状杆菌pld基因原核表达以及PLD蛋白的纯化,再建立了基于伪结核棒状杆菌PLD蛋白的用于检测抗体的间接ELISA检测方法,并将该方法初步应用于临床检测。研究取得结果如下:1.成功克隆伪结核棒状杆菌陕西分离株的pld基因（924 bp）和cp40基因（1134 bp）。其中,pld基因核苷酸序列与其他伪结核棒状杆菌pld基因同源相似性为98%～100%,cp40基因核苷酸序列与其他伪结核棒状杆菌cp40基因的同源相似性为91%～99%。遗传进化分析表明,伪结核棒状杆菌陕西分离株pld基因与英国菌株NCTC4681亲缘关系较近,cp40基因与巴西菌株C231亲缘关系较近。pld和cp40基因核苷酸序列推导得到的氨基酸序列中不含有信号肽,无跨膜区结构域,亲水性较强,并且氨基酸序列存在许多表面抗原。2.构建重组原核表达质粒p ET-28a-pld和p ET-28a-cp40转化BL21,镍柱亲和层析纯化得到大量高纯度大小分别为33 ku PLD蛋白以及41 ku CP40蛋白,Western blot分析,两种重组蛋白能够与伪结核棒状杆菌阳性血清特异性结合,具有一定的反应原性。使用纯化的PLD蛋白作为包被抗原建立伪结核棒状杆菌抗体间接ELISA检测方法,最佳包被量为200 ng,待检血清以1:200稀释,酶标二抗以1:5 000稀释,作用时间均为1h,TMB显色时间为20 min。特异性、灵敏性、重复性均良好,且符合率较高。3.使用PLD蛋白作为包被抗原,对伪结核棒状杆菌抗体胶体金免疫层析检测方法的建立进行研究。其中,分别对标记PLD蛋白的夹心法、基于G蛋白以及兔抗山羊Ig G的间接法进行试验,三种方法目前还未成功,需进一步探索。
宁唤唤[5]（2021）在《结核分枝杆菌ESAT-6的免疫学特性及其在黏膜疫苗中的应用》文中指出研究背景结核病（tuberculosis,TB）是由结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis,Mtb）感染引起的呼吸道传染病。卡介苗（Bacillus Calmette-Guerin,BCG）是目前唯一批准使用的结核病疫苗,但对成人结核病的保护效果不完善,可能与BCG在减毒传代过程中丢失了一些编码保护性抗原的基因序列有关,例如:差异编码区1（region difference,RD1）。因此,新型疫苗的研发有助于更好地防控结核病。6k Da早期分泌靶抗原（6 k Da early secretory antigenic target,ESAT-6）是Mtb与BCG的差异抗原。研究发现,ESAT-6能够诱导机体产生抗Mtb感染的保护性免疫应答,被广泛用于结核病疫苗研究。目前,包含ESAT-6及其他抗原的四种疫苗已进入临床试验。此外,ESAT-6作为毒力因子与Mtb的致病性有关,且参与调控Mtb感染宿主的免疫应答。因此,ESAT-6是结核病疫苗研究中有潜能的候选抗原之一。然而,课题组前期研究发现,ESAT-6抗原诱导的机体免疫应答水平不高。研究发现,细菌信号分子环二腺苷酸（c-di-AMP）不仅调控细菌生理功能,还能诱导宿主固有免疫应答,且作为黏膜佐剂能够增强抗原诱导的特异性免疫应答。因此,本研究旨在探究ESAT-6的免疫学特性,评价ESAT-6亚单位疫苗及以c-di-AMP为佐剂黏膜接种对Mtb感染的保护作用,为ESAT-6用于结核病黏膜疫苗的研制提供理论与实验依据。研究目的探究Mtb ESAT-6同系物Ms ESAT-6在快速生长型分枝杆菌耻垢分枝杆菌（Mycobacterium smegmatis,Ms）调控免疫应答中的作用;探究Mtb的重组ESAT-6蛋白对巨噬细胞固有免疫的调控作用;明确基于Mtb ESAT-6的亚单位疫苗以c-di-AMP为佐剂经黏膜免疫小鼠诱导的免疫应答特点,评价ESAT-6为基础的亚单位疫苗抗Mtb感染的保护效率。方法与结果（1）耻垢分枝杆菌ESAT-6敲除株的免疫学特性1)Ms ESAT-6是Mtb ESAT-6在Ms中的同系物,二者氨基酸序列相似性为72%。采用CRISPR/Cas9技术成功构建了Ms ESAT-6敲除株MsΔE6（ΔE6）,并构建了互补菌株ΔE6 C。生长及染色特性结果显示,敲除ESAT-6对细菌生长有一定影响,但不影响细菌抗酸染色特性。2)建立Ms体外感染巨噬细胞模型,发现ESAT-6在Ms感染诱导巨噬细胞产生炎症因子、诱导炎症小体活化以及自噬中发挥作用,但影响水平有限。3)细菌胞内存活结果显示,敲除ESAT-6的菌株在巨噬细胞内复制减少,说明ESAT-6与Ms在巨噬细胞内存活有关。（2）ESAT-6在调节巨噬细胞固有免疫中的作用1)建立巨噬细胞体外刺激模型,发现c-di-AMP促进了Mtb ESAT-6重组蛋白诱导的I型IFN应答;ESAT-6和c-di-AMP在处理早期可诱导巨噬细胞自噬起始,二者长时间处理主要表现为抑制自噬降解,该过程受m TOR调控但不依赖于IL-17。2)ESAT-6可诱导巨噬细胞炎症因子应答,且c-di-AMP促进了ESAT-6诱导的炎症因子应答。3)Mtb胞内存活结果显示,在感染早期ESAT-6和c-di-AMP以协同的方式限制了Mtb的复制;随着感染时间延长,抑制Mtb生长的作用逐渐不明显。（3）ESAT-6亚单位疫苗的免疫学特性1)以ESAT-6、ESAT-6+c-di-AMP经鼻黏膜接种小鼠,体液免疫应答检测结果显示,ESAT-6可诱导机体系统性和黏膜局部特异性抗体产生,c-di-AMP为黏膜佐剂增强了ESAT-6诱导的体液免疫应答。2)细胞免疫应答检测结果显示,c-di-AMP为佐剂促进了ESAT-6诱导的系统性Th1/Th2/Th17型以及炎症因子应答;同时促进了黏膜局部的Th17型和炎症因子应答。3)肺组织免疫细胞亚群分析结果显示,ESAT-6、ESAT-6+c-di-AMP接种导致CD8+T细胞和巨噬细胞比例减少;同时,c-di-AMP为黏膜佐剂促进了ESAT-6诱导的固有淋巴样细胞ILC1和NK细胞的分化。（4）ESAT-6亚单位疫苗对Mtb感染的免疫保护效率1)ESAT-6免疫小鼠Mtb感染后黏膜免疫应答增强,且c-di-AMP促进了ESAT-6诱导的黏膜免疫应答。2)ESAT-6、ESAT-6+c-di-AMP免疫小鼠Mtb感染后,Th1型（IFN-γ）、Th2（IL-10）、Th17（IL-17）以及炎症因子（IL-1β、IL-6、TNF-α）的产生均减少。3)ESAT-6、ESAT-6+c-di-AMP经黏膜接种小鼠提供了抗Mtb感染的保护作用,且c-di-AMP为佐剂在一定程度上提高了ESAT-6的免疫保护作用。研究结论Ms ESAT-6在Ms感染诱导的宿主固有免疫中发挥一定的作用,影响细菌胞内存活,整体上作用有限。Mtb ESAT-6与免疫调节子c-di-AMP协同激活I型IFN,调控细胞自噬,诱导炎症应答,促进了巨噬细胞清除Mtb感染。ESAT-6经黏膜接种,可诱导体液免疫应答,c-di-AMP为佐剂促进了ESAT-6诱导的黏膜免疫应答以及Th1/Th2/Th17型细胞免疫应答。ESAT-6经黏膜免疫可提供对Mtb感染的保护力,且c-di-AMP在一定程度上可提高ESAT-6的免疫保护效率。
杨航[6]（2020）在《牛结核病诊断技术的建立与初步应用》文中进行了进一步梳理牛结核是由牛分枝杆菌引起的人类和动物的人畜共患传染病,OIE将牛结核病分为B类人畜共患疾病在中国为II类人畜共患疾病。牛结核病每年给畜牧业带来的经济损失不可估量,不仅如此,牛结核病给人类的安全带来重大的隐患,因此对于牛结核病的防控至关重要,本研究希望通过探寻作为快速诊断的靶基因以及抗原蛋白,以免疫酶联吸附试验（ELISA）和实时荧光定量PCR技术为基础,建立针对牛结核病的诊断方法,为结核病的防控提供新的技术手段进行以下研究:（1）通过生物信息学分析的手段,对本试验室前期研究的16种结核特异性蛋白进行分析,通过理化特性、不稳定性指数、亲水性、蛋白质二级结构、跨膜域以及B细胞表位的分布预测为后续试验提供理论数据支持;将16株表达菌经表达纯化,经蛋白免疫印迹试验（Western-Blotting）验证均能与牛结核病阳性的牛血清进行反应,具有良好的反应源性;最终用爱德士牛结核病抗体检测试剂盒对本试验涉及的所有蛋白进行初步筛选,结果显示MPT70和MPT83在牛结核病的间接ELISA检测中具备优秀的诊断效能,可以作为诊断抗原进一步研究。（2）以MPT70蛋白、MPT83蛋白、MPT70-83融合蛋白、MPT70预测的抗原表位肽（M1）、MPT83预测的抗原表位肽（M2）分别为包被抗原建立间接ELISA检测方法,通过方阵滴定,确定其最佳包被浓度、血清稀释度、酶标二抗稀释度以及血清、二抗和显色的最佳反应时间,在各种最佳反应条件下对牛结核阳性的血清和牛结核阴性的血清进行检测,确定其阳性符合率以及阴性符合率。结果显示M1和MPT70的阴阳性符合率以及M2和MPT83的阴阳性符合率相当,可以以抗原多肽代替全蛋白作为诊断抗原。（3）建立一种基于Mpt83基因的实时荧光定量pcr的结核分枝杆菌核酸检测的方法,根据Mpt83基因设计一对特异性引物,以培养的H37RV标准株为模版扩增目的基因并连接T载体,构建标准重组质粒以检测所建方法的有效性。经反应条件的优化建立SYBR Green I实时荧光定量检测方法,结果显示所建立的方法线性关系良好,融解曲线波峰单一,具有很强的特异性与常见致病菌无交叉反应,最低检出下限为10copies/reaction,是常规PCR的100倍,对牛乳模拟标本的检测可达到10 CFU/10m L,可用于病菌的检测及定量分析。本试验通过生物信息学分析以及酶联免疫吸附试验对16种结核特异性蛋白进行初步的筛选,筛选出MPT70、MPT83两种对于牛结核病血清学诊断最具价值的抗原蛋白;分别以MPT70和MPT83两种蛋白和MPT70预测的抗原表位肽（M1）、MPT83预测的抗原表位肽（M2）以及MPT70-83融合蛋白建立间接ELISA检测方法,通过临床样本检测的结果显示两种蛋白的优势抗原表位段均能代替两种蛋白的全蛋白作为诊断抗原;以M PT83为靶基因的建立荧光定量PCR的检测方法,经检测所建立的方法具有良好的特异性,其检出下限可达10copies/reaction,对牛乳模拟标本的检测可达到10 CFU/10m L,可用于定量分析。为牛结核病的快速诊断提供一种新的技术方法。
李娜[7]（2020）在《六种结核菌蛋白抗原的诊断价值及UspC蛋白的抗原性研究》文中研究表明结核病仍是严重威胁人类健康的重大传染病之一。为遏制结核病的严重流行并最终实现终止结核病的目标,迫切需要筛选和评价更多的免疫优势抗原或抗原组合用于结核病的免疫学诊断和新型结核疫苗研发中,以期改善诊断效能并促进有效结核疫苗的研发。本论文基于上述两个角度和方向开展了相关实验研究。一方面,选取了六种T细胞表位覆盖率为100%的结核分枝杆菌特异性蛋白抗原,对它们的独立和组合免疫学诊断价值进行了评价;另一方面,对潜在的免疫优势抗原Rv2318（UspC）的抗原性进行了初步研究。本研究选取 Rv0288、Rv1980c、Rv2029c、Rv2031c、Rv3874 和 Rv3875 六种MTB蛋白进行了免疫学诊断价值评价,并探索了潜在的优势诊断组合物。首先,利用大肠杆菌蛋白表达系统表达了这六种结核分枝杆菌特异性蛋白抗原,并通过亲和层析技术对六种重组蛋白进行了纯化;然后采集了 43名结核病患者（包括菌阳肺结核、菌阴肺结核和肺外结核患者）和38名健康志愿者的静脉血,用来分离外周血单个核细胞进行ELISPOT试验并分离血清进行ELISA实验;最后,使用非参数T检验-Mann-Whitney检验、Dunn’s多重比较检验、ROC分析和Spearman相关分析等方法对检测结果进行统计分析。结果显示,除Rv2029c外的其余五种抗原（Rv0288、Rv1980c、Rv2031c、Rv3874和Rv3875）均具有较好的细胞免疫诊断价值,体现诊断准确度的AUC值分别为0.852、0.814、0.852、0.874和0.872。仅Rv2031c具有一定的体液免疫诊断价值,其AUC为0.637。组合诊断性能分析表明,Rv3874-Rv3875和Rv2031c-Rv3874是优秀的双抗原诊断组合物,Rv2031c-Rv3875-Rv3874 和 Rv0288-Rv3875-Rv3874 是最佳的三抗原诊断组合物。四抗原组合Rv0288-Rv3875-Rv3874-Rv2031c的潜在诊断价值则优于其他所有组合。因此,Rv0288、Rv1980c、Rv2031c、Rv3874和Rv3875五种MTB蛋白自身均具有较好的细胞免疫诊断价值,四抗原组合物Rv0288-Rv3875-Rv3874-Rv2031c是最有诊断潜力的抗原组合。为筛选出更多的免疫优势抗原,本研究还对一种被研究得较少的Rv2318（UspC）蛋白的抗原性进行了初步探索。首先,根据IEDB数据库中Rv2318蛋白的T细胞表位信息,选取了两个表位集中区,通过重叠PCR技术将序列拼接,构建Rv2318P的重组克隆子,并进行了 Rv2318完整蛋白和表位拼接蛋白Rv2318P的表达和纯化;然后,通过采集志愿者（含结核病患者和健康志愿者）的静脉血进行ELISPOT和ELISA实验,评价了 Rv2318和Rv2318P的免疫反应性;最后,在BALB/c小鼠模型中对Rv2318和Rv2318P的免疫原性进行了评价。体外和体内实验的结果表明Rv2318（UspC）蛋白具有较强的免疫反应性和免疫原性,能诱发机体产生较强的细胞免疫和体液免疫反应,因而是有较大潜力的结核疫苗候选抗原。同时,Rv2318和Rv2318P的比较分析表明,Rv2318表位拼接蛋白Rv2318P能有效保留Rv2318完整蛋白的免疫原性和免疫反应性,甚至优于其完整蛋白。证实了表位拼接方式作为优化抗原途径之一的可行性。因此,Rv2318（UspC）蛋白具有较强的抗原性,是潜在的疫苗候选抗原。Rv2318P可能是Rv2318的潜在替代抗原。未来需进一步探索Rv2318和Rv2318P的免疫保护效能,以明确它们作为疫苗成分的潜力以及表位剪接方法的有效性。总而言之,Rv0288、Rv1980c、Rv2031c、Rv3874 和 Rv3875 五种蛋白抗原均具有较好的细胞免疫学诊断价值,它们的组合中,三抗原组合Rv2031c-Rv3875-Rv3874 和 Rv0288-Rv3875-Rv3874 以及四抗原组合 Rv0288-Rv3875-Rv3874-Rv2031c为潜在的IGRAs优秀诊断组合物。Rv2318（UspC）蛋白及其表位拼接蛋白Rv2318P均具有较好的抗原性,是有较大潜力的结核疫苗候选抗原。表位拼接方式是可能的抗原优化的途径之一。
王红[8]（2020）在《结核分枝杆菌新基因编码蛋白抗原性研究及其在结核病诊断中的应用初探》文中研究说明目的结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis,MTB,结核菌）临床分离株生长缓慢、培养难,还易被其它分枝杆菌交叉污染,缺乏高特异性、超灵敏的生物诊断标志物,为结核病（Tuberculosis,TB）的临床精准鉴别诊断和及时治疗带来困难。故建立快速、精准、特异、灵敏的结核病检测技术是控制结核病蔓延的必要前提和基础。前期课题组利用深度覆盖和精准蛋白质组技术对MTB H37Rv菌株进行了高覆盖蛋白质组研究,发现并验证了22个MTB遗漏注释基因,其中一半的基因属于MTB特异性基因。本研究旨在进一步筛选出可用于结核菌体液免疫检测的特异性基因编码蛋白抗原及抗原组合,为将来结核病的快速诊断及试剂盒的开发提供技术支撑。方法首先克隆目的基因,并且为选出高可溶性表达的载体,建立大肠杆菌异源表达体系。分别筛选了p GEX-4T-2、p ET-28a、p ET-32a、p MAL-c2X四种表达载体构建目的基因的重组表达菌株;尝试目的基因密码子和表达条件优化,实现异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（Isopropyl-β-D-thiogalactoside,IPTG）诱导目的蛋白的可溶性表达后进行亲和纯化;对纯化获得的目的蛋白进行质谱验证;基于Bepipred Linear Epitope Prediction（BLEP,v2.0）、Bio Sun和Dlbepitope软件对这些新编码蛋白进行B细胞可信表位的预测;并用酶联免疫吸附试验（ELISA）技术评估这些新编码蛋白在结核病体液免疫诊断中的潜在应用价值。结果1四种不同载体中,pMAL-c2X表达载体均有效实现了22个新编码蛋白的可溶性诱导表达。纯化获得的新基因编码蛋白经质谱检测,序列正确。2经Bepipred Linear Epitope Prediction（BLEP,v2.0）、Bio Sun和Dlbepitope软件进行B细胞表位预测,发现这些新蛋白均具有高可信的表位,且为先前尚未报道的表位。3初步血清学比较发现,p MAL-c2X空载在检测中背景干扰最小,适于后续融合表达蛋白的血清学抗原性筛选。对p MAL-c2X载体获得的融合蛋白进行了血清学检测,共筛选到2个潜在抗原TB38.76和TB26.88。抗原TB38.76在结核病患者的灵敏度是68.33%,特异度为72.5%。TB38.76在菌培养阳性的患者中,灵敏度是90%,特异度为55%;抗原TB26.88在菌培养阳性患者中,灵敏度是80%,特异度为50%。4 TB26.88、TB38.76、38 k Da蛋白和商品化试剂盒（上海荣盛结核分枝杆菌Ig G抗体检测试剂盒）进行并联试验或串联试验后,具有互补性,可有效提高对结核病的诊断效率。结论1利用大肠杆菌异源表达系统,基于p GEX-4T-2、p ET-28a、p ET-32a、p MAL-c2X四种载体成功构建了22个MTB新基因的重组质粒,且在p MAL-c2X载体中均实现了高可溶性诱导表达。2 22个新抗原筛选获得了2个潜在的新抗原TB26.88和TB38.76,与已知抗原和商品化试剂盒在结核病诊断中呈现互补性,为将来组合抗原的优化及试剂盒开发提供了科学依据。图12幅;表18个;参116篇。
张哲[9]（2020）在《新疆部分地区牛副结核病流行病学调查及抗体ELISA检测方法研究》文中研究表明牛副结核病是由副结核分支杆菌（Mycobacterium avium subsp.Paratuberculosis,MAP）引起的慢性增生性肠炎,主要表现为肠道出现浆液性分泌物,伴随长期腹泻以及体况不良,有时危及病畜生命,使畜牧业遭受经济损失。国外是强制通报的传染病,我国定为二类动物疫病。新疆地区牛场时有该病发生,但存在临床与其他疾病易混淆,难于鉴别诊断的问题。本项研究对新疆不同地区牛场血清进行抗体检测,对临床疑似病例进行分子生物学诊断,探索建立该病的血清学ELISA检测方法,为该病的诊断和防控提供技术支持。目的:调查新疆不同地区牛场牛副结核病血清抗体阳性情况,利用分子生物学方法诊断牛副结核病疑似病例,掌握临床该病流行和发病情况;筛选副结核分枝杆菌重要抗原蛋白,建立该病抗体检测的间接ELISA方法,为建立适合本地区的牛副结核病的诊断方法提供参考意见。方法:1.采集新疆石河子、沙湾、奎屯等13个地区的牛场血液样本681份进行抗体检测;2.对临床64份疑似发病牛粪便样本进行PCR法检测;3.分析牛副结核分枝杆菌重要抗原蛋白表位构建串联重组蛋白MAP3290-1595表达载体,转化大肠杆菌经IPTG诱导表达;4.通过Western Blot和间接ELISA方法验证重组蛋白MAP3290-1595反应原性;5.棋盘方阵滴定法筛选基于重组蛋白建立的间接ELISA方法最优条件。结果:1.新疆不同地区牛副结核病血清抗体平均阳性率为6.17%（42/681）,不同地区存在差异;2.对临床疑似病例PCR检测阳性率81.25%（52/64）,阳性基因片段经测序确定均为Mycobacterium avium subsp.Paratuberculosis,且7个序列同源性100%;3.成功诱导表达和纯化串联重组蛋白MAP3290-1595,浓度为0.430 mg/mL,纯度大于90%;4.Western Blot和间接ELISA方法证实重组蛋白MAP3290-1595与牛副结核阳性血清具有较好反应原性。5.初步筛选出重组蛋白建立的间接ELISA方法最优条件。结论:1.新疆不同地区牛场均存在牛副结核病感染情况,临床腹泻病牛中感染牛副结核分枝杆菌比例较高;2.成功表达牛副结核分枝杆菌串联重组蛋白MAP3290-1595,初步建立了MAP抗体间接ELISA检测方法。为该病在新疆地区诊断和防控提供基础数据。
常蕴青[10]（2020）在《结核分枝杆菌毒素—抗毒素系统mt-PemIK功能和作用机制的研究》文中研究表明目的:通过生物信息学和体内外实验等方法鉴定一对新的TA系统mt-Pem IK,构建H37Rv△Pem K敲除株,观察mt-Pem IK对耻垢分枝杆菌和结核分枝杆菌生长的影响,进而揭示其在结核分枝杆菌中的功能和作用机制,补充和完善结核分枝杆菌毒素-抗毒素系统的功能,进一步阐释结核分枝杆菌持留及致病性形成的相关机制。方法:首先,运用生物信息学的方法在结核分枝杆菌基因组中搜索并寻找一对新的TA系统,分析其结构特点是否属于TA系统,以耻垢分枝杆菌为模式生物,验证mt-Pem K和mt-Pem I的功能及相互作用机制,分析其功能是否符合TA系统的特点;其次,运用噬菌体介导的同源重组方法构建H37Rv△Pem K敲除株,并经PCR、实时荧光定量PCR及测序等方法进行验证,然后观察野生株H37Rv和敲除株H37Rv△Pem K在正常培养和不同压力应激培养条件下的生长情况;再次,分别构建野生株和敲除株RAW264.7细胞感染模型,比较CFU计数、细胞因子表达水平和细胞凋亡水平变化的差异;最后,分别构建野生株和敲除株动物感染模型,观察小鼠一般情况,比较肺脏、脾脏病理形态、CFU计数及细胞因子表达水平的差异。结果:1.在结核分枝杆菌基因组中发现了一对新的TA系统,称其为mtPem IK。当在耻垢菌株中导入mt-Pem K并诱导表达,发现其产物Pem K蛋白具有抑制耻垢分枝杆菌生长的毒性作用,蛋白Pem I可以发挥拮抗Pem K的毒性作用,使生长抑制的耻垢菌株恢复正常生长,Pem I为抗毒素蛋白,证实mtPem IK是一个典型的II型TA系统。2.提取H37Rv△Pem K敲除株的DNA和RNA,经PCR、实时荧光定量PCR及测序等方法证实敲除株构建成功。3.在正常培养条件下,结核分枝杆菌野生株与敲除株生长差异无统计学意义,但在各种压力应激条件下,无论是野生株还是敲除株生长均明显受到抑制,其中在酸性PH、高渗透压、厌氧的条件下,敲除株比野生株生长更慢。4.细胞实验显示,在感染0h、24h、48h,野生株组CFU计数比敲除株组均高,感染0h差异具有统计学意义;在感染24h,野生株组的IL-1α、IL-10达分泌最高峰,与敲除株组相比差异具有统计学意义,而敲除株组分泌高峰延迟;在感染4h,实验两组均出现IL-6分泌最高峰,在感染24h两组差异具有统计学意义;在感染48h,野生株组出现IL-12分泌最高峰,而敲除株组在感染72h出现分泌最高峰;在感染0h,野生株组与敲除株组TNF-α均达分泌最高峰;感染72h,野生株组IFN-γ分泌水平明显升高,与敲除株组相比差异有统计学意义;随着感染时间的延长,野生株组与敲除株组诱导的凋亡率均逐渐升高,在感染24h,敲除株组诱导的凋亡水平更高,两组差异有统计学意义。5.动物实验显示,在感染最初的2月,敲除株组小鼠体重增长速度、组织炎症反应程度及CFU菌落计数情况均较野生株组小鼠加重,在感染最初1月、2月,主要以敲除株组血浆IL-6、IL-10的分泌水平升高为主,而在感染3月时,则以野生株组血浆IFN-γ的分泌水平升高为主。结论:本研究发现并鉴定了结核分枝杆菌一个新的TA系统mt-Pem IK;利用高滴度噬菌体介导的基因重组工程技术构建结核分枝杆菌基因敲除株的方法可行;在压力应激条件下,TA系统可能参与了结核分枝杆菌的生长调控,其中,mt-Pem IK参与调控的条件与酸性PH、渗透压及厌氧的压力应激条件有关;体外细胞实验证实,野生株的存活能力和毒力均强于敲除株;动物实验证实,mt-Pem K基因可能通过影响结核分枝杆菌的毒力,调控其生长。
二、血清稀释度对ELISA法检测结核病人血清抗体结果的影响（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、血清稀释度对ELISA法检测结核病人血清抗体结果的影响（论文提纲范文）
（1）江苏睢宁县2018-2020年奶牛布鲁氏菌病、结核病流行病学调查及综合防控技术示范（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 布鲁氏菌病、结核病概述 |
| 1 布鲁氏菌病概述 |
| 1.1 病原特性 |
| 1.2 流行特点 |
| 1.3 发病机理 |
| 1.4 临床症状 |
| 1.5 病理变化 |
| 1.6 诊断技术 |
| 2 结核病概述 |
| 2.1 病原特性 |
| 2.2 流行特点 |
| 2.3 发病机理 |
| 2.4 临床症状 |
| 2.5 病理变化 |
| 2.6 诊断技术 |
| 3 研究目的与意义 |
| 第二章 试验研究 |
| 试验一 睢宁县规模化奶牛场布鲁氏菌病流行病学调查 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 主要试剂 |
| 1.1.2 主要仪器设备 |
| 1.1.3 样品采集 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 虎红平板凝集试验 |
| 1.2.2 试管凝集试验 |
| 1.2.3 竞争酶联免疫吸附试验 |
| 2 结果 |
| 2.1 不同年份的布鲁氏菌病调查情况 |
| 2.2 不同规模的奶牛场布鲁氏菌病调查情况 |
| 2.3 不同方法的布鲁氏菌病检测情况 |
| 3 讨论与小结 |
| 试验二 睢宁县规模化奶牛场结核病流行病学调查 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 主要试剂 |
| 1.1.2 主要仪器设备 |
| 1.1.3 样品采集 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 牛型结核分枝杆菌PPD皮内变态反应试验 |
| 1.2.2 γ-干扰素体外释放试验 |
| 2 结果 |
| 2.1 不同年份的牛结核病调查情况 |
| 2.2 不同规模的奶牛场牛结核病调查情况 |
| 2.3 不同方法的牛结核病检测情况 |
| 3 讨论与小结 |
| 试验三 布鲁氏菌病新型快速检测方法对比试验 |
| 1 新型快速检测方法介绍 |
| 2 新型快速检测方法步骤 |
| 3 对比检测结果 |
| 4 讨论与小结 |
| 第三章 以睢宁县D牛场为例开展奶牛养殖场布病、结核病净化技术的研究与示范 |
| 1 示范项目背景 |
| 2 示范项目具体措施 |
| 2.1 指导牛场重建 |
| 2.2 指导科学养殖 |
| 2.3 采用发酵床养殖技术 |
| 2.4 坚持自繁自养 |
| 2.5 加强人员防护 |
| 2.6 组织参加培训 |
| 2.7 规章制度上墙 |
| 2.8 搭建智慧牧场系统 |
| 2.9 及时跟踪检测 |
| 3 示范项目应用试验 |
| 3.1 奶牛发酵床养殖原位降解粪污技术应用试验 |
| 3.1.1 应用试验介绍 |
| 3.1.2 试验方法 |
| 3.1.3 试验结果与讨论 |
| 3.2 《智慧牧场信息化技术集成系统》应用试验 |
| 3.2.1 应用试验介绍 |
| 3.2.2 试验方法 |
| 3.2.3 试验结果与讨论 |
| 4 示范项目净化效果 |
| 5 小结 |
| 6 深化综合防控措施 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
（2）新疆汉族人群结核分枝杆菌免疫优势Th表位的筛选与鉴定（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 主要符号表及缩略词 |
| 绪论(Introduction) |
| 第一部分 新疆汉族人群结核分枝杆菌免疫优势Th表位的预测与合成 |
| 材料(Materials) |
| 1.1 一般资料 |
| 1.2 主要试剂及公司 |
| 1.3 主要仪器设备 |
| 方法(Methods) |
| 2.1 同源性分析 |
| 2.2 应用DNAStar软件分析结核分枝杆菌抗原蛋白序列 |
| 2.3 结核分枝杆菌蛋白的Th细胞表位预测 |
| 2.4 预测表位肽在三维结构中的定位分析 |
| 2.5 预测表位肽的合成、纯度分析及分子质量测定 |
| 2.5.1 合成预测表位肽 |
| 2.5.2 预测表位肽的纯度分析 |
| 2.5.3 预测表位肽的分子质量测定 |
| 结果(Results) |
| 3.1 抗原蛋白同源性分析结果 |
| 3.2 应用DNAStar软件对抗原蛋白进行氨基酸序列分析 |
| 3.2.1 Rv3874蛋白氨基酸序列分析结果 |
| 3.2.2 Rv0934蛋白氨基酸序列分析结果 |
| 3.2.3 Rv3804c蛋白氨基酸序列分析结果 |
| 3.2.4 Rv3875蛋白氨基酸序列分析结果 |
| 3.2.5 Rv3878蛋白氨基酸序列分析结果 |
| 3.3 结核分枝杆菌蛋白的Th细胞表位预测 |
| 3.3.1 SYFPEITHI软件预测分析结果 |
| 3.3.2 RANKPEP软件预测分析结果 |
| 3.3.3 NetMHCⅡpan软件预测分析结果 |
| 3.4 结核分枝杆菌预测表位肽的三维结构分析 |
| 3.5 预测表位肽的合成、纯度分析及分子质量测定 |
| 3.5.1 预测表位肽的纯度分析结果 |
| 3.5.2 预测表位肽的分子质量分析结果 |
| 讨论(Discussion) |
| 小结(Preliminary Summary) |
| 第二部分 新疆汉族人群结核分枝杆菌免疫优势Th表位的初步筛选 |
| 材料(Materials) |
| 1.1 主要试剂及公司 |
| 1.2 主要仪器设备 |
| 方法(Methods) |
| 2.1 关于实验材料血液样本的采集和样本量的确定 |
| 2.1.1 人群纳入标准 |
| 2.1.2 样本量的确定 |
| 2.1.3 研究样本的采集 |
| 2.2 利用PCR-SSO技术进行结核病患者HLA-DRBI*0701阳阴性的筛选 |
| 2.2.1 结核患者血液样本DNA的提取 |
| 2.2.2 PCR-SSO技术进行HLA-DR位点高分辨基因分型检测 |
| 2.3 采用密度梯度离心法提取PBMC |
| 2.4 预测表位多肽的溶解和保存 |
| 2.4.1 预测表位多肽的溶解 |
| 2.4.2 预测表位多肽的冻干及保存 |
| 2.5 CCK8法进行体外细胞增殖实验,检测不同多肽浓度对淋巴细胞增殖水平的影响 |
| 2.6 CCK8法检测细胞增殖,进行结核分枝杆菌Th预测表位肽的初步筛选 |
| 2.7 统计学分析 |
| 结果(Results) |
| 3.1 不同多肽浓度对淋巴细胞增殖水平的影响 |
| 3.2 结核分枝杆菌Th预测表位多肽的初步筛选 |
| 讨论(Discussion) |
| 小结(Preliminary Summary) |
| 第三部分 新疆汉族人群结核分枝杆菌免疫优势Th表位的鉴定 |
| 材料(Materials) |
| 1.1 主要试剂及公司 |
| 1.2 主要仪器设备 |
| 方法(Methods) |
| 2.1 关于实验材料血液样本的采集和样本量的确定 |
| 2.1.1 人群纳入标准 |
| 2.1.2 血清学实验样本量的确定 |
| 2.1.3 研究样本的采集 |
| 2.2 BrdU法对候选多肽进行CD4+T细胞增殖分析 |
| 2.3 流式细胞术进行候选多肽刺激淋巴细胞增殖的表型分析 |
| 2.4 ELISA法检测候选多肽刺激CD4+T细胞分泌细胞因子水平 |
| 2.5 候选多肽作为包被抗原,确定间接ELISA检测血清IgG抗体最佳条件 |
| 2.6 间接ELISA做临床样本的检测,对候选肽进行血清学评价 |
| 2.7 统计学分析 |
| 结果(Results) |
| 3.1 BrdU法检测CD4+T细胞增殖 |
| 3.2 流式细胞术进行候选多肽刺激淋巴细胞增殖的表型分析 |
| 3.3 候选多肽刺激CD4+T细胞分泌细胞因子 |
| 3.4 候选表位多肽的血清学评价 |
| 3.4.1 间接ELISA检测结核病抗体方法的建立 |
| 3.4.2 候选表位多肽在检测结核病效能的评价分析 |
| 讨论(Discussion) |
| 小结(Preliminary Summary) |
| 展望与总结(Outlook and Summary) |
| 全文结论(Full Text Conclusion) |
| 参考文献(References) |
| 文献综述(Review) 结核分枝杆菌T细胞免疫优势表位的研究应用进展 |
| 参考文献 |
| 致谢(Acknowledgements) |
| 作者简介 |
| 石河子大学硕士研究生学位论文导师评阅表 |
（3）类鼻疽菌Hcp1及外膜多糖的制备与免疫学性质研究（论文提纲范文）
| 缩略词表 |
| Abstract |
| 中文摘要 |
| 第一章 前言 |
| 第二章 类鼻疽菌Hcp1 的重组表达及其免疫学性质研究 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.4 总结与讨论 |
| 第三章 类鼻疽菌外膜多糖的结构表征及其免疫学性质研究 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.4 总结与讨论 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 文献综述 基于细菌表面多糖的糖芯片技术应用研究 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 在读期间成果 |
| 致谢 |
（4）基于PLD蛋白的伪结核棒状杆菌抗体间接ELISA检测方法的建立及初步应用（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 文献综述 |
| 第一章 伪结核棒状杆菌及羊干酪性淋巴结炎研究进展 |
| 1.1 伪结核棒状杆菌概述 |
| 1.1.1 形态结构及生理学特性 |
| 1.1.2 耐药性 |
| 1.1.3 感染 |
| 1.1.4 机体抗细菌免疫反应 |
| 1.2 伪结核棒状杆菌抗原蛋白研究进展 |
| 1.2.1 PLD |
| 1.2.2 CP40 |
| 1.2.3 其他抗原 |
| 1.3 羊干酪性淋巴结炎概述 |
| 1.3.1 临床症状与病理变化 |
| 1.3.2 国内外流行情况 |
| 1.3.3 防控 |
| 1.4 检测方法研究进展 |
| 1.4.1 病原学检测 |
| 1.4.2 血清学检测 |
| 1.4.3 分子生物学检测 |
| 1.5 疫苗概述 |
| 1.5.1 疫苗概述 |
| 1.5.2 减毒活疫苗 |
| 1.5.3 类毒素疫苗 |
| 1.5.4 基于PLD和CP40 蛋白的疫苗 |
| 1.5.5 亚单位疫苗 |
| 1.6 间接ELISA检测方法、胶体金免疫层析检测方法简介 |
| 1.6.1 间接ELISA检测方法 |
| 1.6.2 胶体金免疫层析检测方法 |
| 1.7 本研究的目的意义 |
| 试验研究 |
| 第二章 伪结核棒状杆菌pld和cp40 基因克隆及序列分析 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 菌株 |
| 2.1.2 主要试剂和仪器 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 细菌培养及基因组提取 |
| 2.2.2 pld和cp40 基因克隆 |
| 2.2.3 序列比对分析及遗传进化分析 |
| 2.2.4 核苷酸推导的氨基酸序列特征分析 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 基因PCR扩增结果 |
| 2.3.2 pld和cp40 基因序列比对分析及遗传进化分析结果 |
| 2.3.3 pld基因核苷酸推导的氨基酸序列特征分析结果 |
| 2.3.4 cp40 基因核苷酸推导的氨基酸序列特征分析结果 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 第三章 PLD和 CP40 蛋白原核表达及间接ELISA检测方法建立及初步应用 |
| 3.1 材料 |
| 3.1.1 质粒与血清 |
| 3.1.2 主要试剂和仪器 |
| 3.2 方法 |
| 3.2.1 重组质粒的构建 |
| 3.2.2 重组蛋白诱导表达条件的优化及表达形式分析 |
| 3.2.3 重组蛋白纯化及复性 |
| 3.2.4 重组蛋白免疫反应原性分析 |
| 3.2.5 间接ELISA最佳工作条件的确定 |
| 3.2.6 间接ELISA临界值的确定 |
| 3.2.7 间接ELISA特异性试验 |
| 3.2.8 间接ELISA灵敏性试验 |
| 3.2.9 间接ELISA批内、批间重复性试验 |
| 3.2.10 间接ELISA符合率试验 |
| 3.2.11 间接ELISA临床样本检测 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 重组质粒的鉴定 |
| 3.3.2 重组蛋白诱导表达最优条件 |
| 3.3.3 重组蛋白表达形式分析及纯化 |
| 3.3.4 重组蛋白免疫反应原性分析结果 |
| 3.3.5 间接ELISA最佳工作条件 |
| 3.3.6 间接ELISA临界值 |
| 3.3.7 间接ELISA特异性试验结果 |
| 3.3.8 间接ELISA灵敏性试验结果 |
| 3.3.9 间接ELISA重复性试验结果 |
| 3.3.10 间接ELISA符合率试验结果 |
| 3.3.11 临床样本检测结果 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 第四章 基于PLD蛋白的伪结核棒状杆菌抗体胶体金检测方法的初步建立 |
| 4.1 材料 |
| 4.1.1 血清 |
| 4.1.2 主要试剂仪器 |
| 4.2 方法 |
| 4.2.1 基于PLD蛋白的双抗原夹心法原理 |
| 4.2.2 基于G蛋白的间接法原理 |
| 4.2.3 基于兔抗山羊IgG的间接法原理 |
| 4.2.4 胶体金与标记物结合的最佳p H值的确定 |
| 4.2.5 最佳标记物用量的确定 |
| 4.2.6 材料的预处理 |
| 4.2.7 最佳检测线和质控线浓度 |
| 4.2.8 胶体金试纸条组装 |
| 4.2.9 胶体金试纸条判定标准 |
| 4.2.10 胶体金试纸条特异性试验 |
| 4.2.11 胶体金试纸条稳定性试验 |
| 4.2.12 胶体金试纸条重复性试验 |
| 4.3 结果 |
| 4.3.1 基于PLD蛋白的双抗原夹心法结果 |
| 4.3.2 基于G蛋白的间接法结果 |
| 4.3.3 基于兔抗山羊IgG的间接法结果 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 个人简介 |
（5）结核分枝杆菌ESAT-6的免疫学特性及其在黏膜疫苗中的应用（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略语对照表 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 结核病新疫苗研究进展 |
| 1.1.1 进入临床试验的结核病疫苗 |
| 1.1.2 结核病亚单位疫苗的候选抗原 |
| 1.2 ESAT-6 蛋白研究进展 |
| 1.2.1 ESAT-6 蛋白概述 |
| 1.2.2 ESAT-6在Mtb致病性中的作用 |
| 1.2.3 ESAT-6 调控宿主固有免疫应答 |
| 1.2.4 ESAT-6 作为疫苗候选抗原的研究 |
| 1.3 亚单位疫苗的佐剂研究 |
| 1.4 细菌信号分子c-di-AMP在感染与免疫中的作用 |
| 1.4.1 c-di-AMP调节细菌的生理 |
| 1.4.2 c-di-AMP调节宿主固有免疫应答 |
| 1.4.3 c-di-AMP在疫苗佐剂中的应用 |
| 1.5 黏膜免疫 |
| 1.5.1 sIgA介导的体液免疫应答 |
| 1.5.2 黏膜局部的细胞免疫应答 |
| 1.6 本研究设想 |
| 第二章 耻垢分枝杆菌ESAT-6 敲除株的免疫学特性 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 菌株与质粒 |
| 2.1.2 细胞系 |
| 2.1.3 培养基及缓冲液 |
| 2.1.4 试剂 |
| 2.1.5 主要仪器 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 sg RNA敲除质粒的构建 |
| 2.2.2 Ms的培养、计数与感受态制备 |
| 2.2.3 MsΔE6 敲除株的构建与鉴定 |
| 2.2.4 MsΔE6 互补株的构建与鉴定 |
| 2.2.5 r Ms生长及抗酸特性检测 |
| 2.2.6 r Ms感染巨噬细胞模型建立 |
| 2.2.7 基因转录水平检测 |
| 2.2.8 蛋白表达水平检测 |
| 2.2.9 r Ms在巨噬细胞内的存活 |
| 2.2.10 统计学分析 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.3.1 Ms ESAT-6与Mtb ESAT-6 氨基酸序列分析 |
| 2.3.2 MsΔE6 突变株的构建与鉴定 |
| 2.3.3 MsΔE6 互补株的构建与鉴定 |
| 2.3.4 rMs的生长及抗酸特性 |
| 2.3.5 rMs感染巨噬细胞诱导炎症因子的转录水平 |
| 2.3.6 rMs感染巨噬细胞诱导i NOS的转录水平 |
| 2.3.7 rMs感染巨噬细胞激活炎症小体 |
| 2.3.8 rMs感染诱导巨噬细胞自噬 |
| 2.3.9 rMs在巨噬细胞内的存活 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 第三章 ESAT-6 在调节巨噬细胞固有免疫中的作用 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.1.1 菌株与细胞系 |
| 3.1.2 实验动物 |
| 3.1.3 培养基 |
| 3.1.4 试剂 |
| 3.1.5 主要仪器 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 ESAT-6 蛋白纯化 |
| 3.2.2 BMDM的分离与诱导 |
| 3.2.3 Mtb培养与计数 |
| 3.2.4 巨噬细胞体外刺激 |
| 3.2.5 基因转录水平检测 |
| 3.2.6 蛋白表达水平检测 |
| 3.2.7 免疫荧光分析 |
| 3.2.8 ELISA检测细胞因子分泌水平 |
| 3.2.9 Mtb在巨噬细胞中的存活 |
| 3.2.10 统计学分析 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.3.1 ESAT-6 蛋白的纯化 |
| 3.3.2 ESAT-6 诱导巨噬细胞I型 IFN应答 |
| 3.3.3 ESAT-6 调控巨噬细胞自噬 |
| 3.3.4 m TOR在 ESAT-6 调控自噬中的作用 |
| 3.3.5 IL-17在ESAT-6 通过m TOR调控自噬中的作用 |
| 3.3.6 ESAT-6 促进MH-S细胞炎症因子的释放 |
| 3.3.7 ESAT-6 抑制Mtb在 MH-S细胞内存活 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 第四章 ESAT-6 亚单位疫苗的免疫学特性 |
| 4.1 实验材料 |
| 4.1.1 临床样本信息 |
| 4.1.2 伦理声明 |
| 4.1.3 实验动物 |
| 4.1.4 细胞培养基 |
| 4.1.5 试剂 |
| 4.1.6 主要仪器 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.0 亚单位疫苗的制备 |
| 4.2.1 动物免疫策略 |
| 4.2.2 抗体水平检测 |
| 4.2.3 肺组织免疫细胞亚群分析 |
| 4.2.4 脾淋巴细胞分离 |
| 4.2.5 脾淋巴细胞增殖检测 |
| 4.2.6 脾细胞分泌的细胞因子检测 |
| 4.2.7 组织总RNA提取 |
| 4.2.8 呼吸道菌群分析 |
| 4.2.9 统计学分析 |
| 4.3 实验结果 |
| 4.3.1 结核病患者血清特异性抗体水平 |
| 4.3.2 亚单位疫苗诱导的体液免疫应答 |
| 4.3.3 亚单位疫苗诱导的脾脏细胞免疫应答 |
| 4.3.4 亚单位疫苗诱导的肺部细胞免疫应答 |
| 4.3.5 亚单位疫苗黏膜免疫对呼吸道菌群的影响 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 小结 |
| 第五章 ESAT-6 亚单位疫苗对Mtb感染的免疫保护效率 |
| 5.1 实验材料 |
| 5.1.1 菌株与实验动物 |
| 5.1.2 培养基 |
| 5.1.3 试剂 |
| 5.1.4 主要仪器 |
| 5.2 实验方法 |
| 5.2.1 小鼠Mtb感染模型的建立 |
| 5.2.2 抗体水平检测 |
| 5.2.3 脾淋巴细胞增殖检测 |
| 5.2.4 脾细胞分泌的细胞因子检测 |
| 5.2.5 脏器荷菌数 |
| 5.2.6 统计学分析 |
| 5.3 实验结果 |
| 5.3.1 免疫小鼠Mtb感染后的体液免疫应答水平 |
| 5.3.2 免疫小鼠Mtb感染后脾淋巴细胞增殖 |
| 5.3.3 免疫小鼠Mtb感染后诱导的脾细胞因子分泌水平 |
| 5.3.4 免疫小鼠Mtb感染后脏器荷菌数 |
| 5.4 讨论 |
| 5.5 小结 |
| 结论 |
| 展望 |
| 本研究创新点 |
| 参考文献 |
| 攻读博士学位期间取得的研究成果 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（6）牛结核病诊断技术的建立与初步应用（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| abstract |
| 英文词缩略表 |
| 第一章 文献综述 |
| 1 牛结核病简介 |
| 2 牛结核病流行病学 |
| 2.1 自然及生态因素的影响 |
| 2.2 牛结核病分子流行病学研究 |
| 3 牛结核病防控措施 |
| 4 结核病的诊断方法 |
| 4.1 结核特异性抗原蛋白研究进展 |
| 4.2 细菌学诊断方法 |
| 4.2.1 改良抗酸染色法 |
| 4.2.2 噬菌体生物扩增技术 |
| 4.2.3 分枝杆菌生长指标管 |
| 4.3 分子生物学诊断方法 |
| 4.3.1 PCR检测方法 |
| 4.3.2 DNA探针检测 |
| 4.4 免疫学诊断方法 |
| 4.4.1 纯化的结核菌素皮内过敏试验 |
| 4.4.2 皮内比较过敏试验 |
| 4.4.3 IFN-测定 |
| 4.4.4 ELISA诊断方法 |
| 第二章 试验部分 |
| 试验一 牛结核病血清学特异性诊断抗原的筛选 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 主要试剂 |
| 1.1.2 主要仪器 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 结核特异性蛋白基因在致病性分枝杆菌中的同源性分布 |
| 1.2.2 结核特异性蛋白理化分析 |
| 1.2.3 结核特异性蛋白二级结构分析 |
| 1.2.4 结核特异性蛋白跨膜结构域的预测 |
| 1.2.5 结核特异性蛋白B细胞表位预测 |
| 1.2.6 结核特异性蛋白表达菌株的复苏 |
| 1.2.7 结核特异性蛋白的表达及纯化 |
| 1.2.8 结核特异性蛋白浓度的测定 |
| 1.2.9 结核特异性蛋白Western Blot验证 |
| 1.2.10 结核特异性蛋白酶联免疫吸附试验初步筛选 |
| 2 结果 |
| 2.1 结核特异性基因在致病性分枝杆菌中的同源性分布 |
| 2.2 结核特异性蛋白理化分析 |
| 2.3 结核特异性蛋白二级结构分析 |
| 2.4 结核特异性蛋白跨膜结构域的预测 |
| 2.5 结核特异性蛋白B细胞表位分析 |
| 2.6 结核特异性蛋白的表达以及纯化 |
| 2.7 结核特异性蛋白浓度的测定 |
| 2.8 结核特异蛋白Western Blot验证 |
| 2.9 结核特异性蛋白酶联免疫吸附试验初步筛选 |
| 3 讨论 |
| 试验二 牛结核病间接ELISA方法的建立 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.2 主要仪器 |
| 1.1.3 血清来源 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 引物的设计合成 |
| 1.2.2 目的基因的扩增 |
| 1.2.3 PCR产物的鉴定和纯化回收 |
| 1.2.4 目的基因与T载体的连接 |
| 1.2.5 阳性克隆菌落的PCR鉴定 |
| 1.2.6 质粒提取、T载体双酶切与片段回收 |
| 1.2.7 重组原核表达载体的构建 |
| 1.2.8 表达载体阳性克隆的菌液PCR鉴定与测序 |
| 1.2.9 重组蛋白的表达及最佳诱导时间的确定 |
| 1.2.10 蛋白的可溶性鉴定及纯化 |
| 1.2.11 纯化蛋白的浓度测定以及Western Blot验证 |
| 1.2.12 间接ELISA最佳反应条件的筛选 |
| 1.2.13 间接ELISA特异性和敏感性试验 |
| 1.2.14 间接 ELISA 检测临床血清样本检测 |
| 2 结果 |
| 2.1 结核分枝杆菌基因的扩增 |
| 2.2 pMD-19T载体重组质粒构建 |
| 2.3 目的基因与原核表达载体重组构建 |
| 2.4 目的蛋白的表达及纯化 |
| 2.5 蛋白Western Blot分析 |
| 2.6 间接ELISA检测结核病抗体方法的建立 |
| 2.7 间接 ELISA 特异性试验 |
| 2.8 间接 ELISA 敏感性试验 |
| 2.9 间接 ELISA 检测牛结核病血清的阴阳性符合率 |
| 3 讨论 |
| 试验三 结核分枝杆菌实时荧光定量检测方法的初步建立 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 菌株 |
| 1.1.2 仪器与试剂 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 引物的设计与合成 |
| 1.2.2 菌株培养和DNA模版的制备 |
| 1.2.3 标准阳性模版的制备 |
| 1.2.4 建立SYBR Green I法实时荧光定量PCR标准曲线 |
| 1.2.5 特异性检测 |
| 1.2.6 灵敏性检测 |
| 1.2.7 模拟标本的检测 |
| 2 结果 |
| 2.1 引物的设计 |
| 2.2 目的基因的扩增以及重组质粒的构建 |
| 2.3 标准曲线的建立以及融解曲线的分析 |
| 2.4 荧光定量PCR的敏感性 |
| 2.5 荧光定量PCR的特异性检测 |
| 2.6 模拟样本的检测 |
| 3 讨论 |
| 全文总结 |
| 论文创新点 |
| 致谢 |
| 作者简历 |
| 参考文献 |
| 附件 |
（7）六种结核菌蛋白抗原的诊断价值及UspC蛋白的抗原性研究（论文提纲范文）
| 缩略词 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 第一部分 六种结核分枝杆菌蛋白抗原的诊断价值评价 |
| 前言 |
| 1. 实验材料与仪器 |
| 1.1 菌株和质粒 |
| 1.2 主要试剂及试剂配制 |
| 1.3 主要仪器与耗材 |
| 2. 实验方法 |
| 2.1 六种重组蛋白的表达和纯化 |
| 2.2 人外周血样本的采集 |
| 2.3 人外周血ELISPOT实验 |
| 2.4 人血清ELISA实验 |
| 2.5 统计分析 |
| 3. 实验结果 |
| 3.1 六种重组蛋白的纯化结果 |
| 3.2 ELISPOT结果 |
| 3.3 ELISA检测结果 |
| 3.4 组合诊断价值分析 |
| 3.5 六种抗原相关分析 |
| 4. 讨论 |
| 第二部分 UspC蛋白的抗原性研究 |
| 前言 |
| 1. 实验仪器与试剂 |
| 1.1 菌株和质粒 |
| 1.2 主要仪器和耗材 |
| 1.3 主要试剂及试剂配制 |
| 2. 实验方法 |
| 2.1 Rv2318P克隆子构建及三种蛋白的表达纯化 |
| 2.2 Rv2318和Rv2318P蛋白的体外免疫学评价 |
| 2.3 小鼠免疫 |
| 2.4 小鼠处死及脾细胞分离 |
| 2.5 ELISA双抗夹心法检测脾细胞培养上清的细胞因子浓度 |
| 2.6 ELISA间接法检测小鼠血清IgG、IgG1和IgG2a抗体滴度 |
| 2.7 统计分析 |
| 3. 实验结果 |
| 3.1 重组Rv2318和Rv2318P蛋白的大小及纯度 |
| 3.2 体外免疫学评价结果 |
| 3.3 抗原刺激后小鼠脾淋巴细胞分泌的细胞因子水平 |
| 3.4 小鼠血清中的抗原特异性抗体滴度 |
| 4. 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 结核分枝杆菌感染免疫机制研究进展(综述) |
| 参考文献 |
| 个人简历 |
| 发表文章 |
| 致谢 |
（8）结核分枝杆菌新基因编码蛋白抗原性研究及其在结核病诊断中的应用初探（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 英文缩略表 |
| 引言 |
| 第1章 结核分枝杆菌新基因的原核克隆表达及纯化 |
| 1.1 材料与方法 |
| 1.1.1 质粒及菌株 |
| 1.1.2 主要试剂 |
| 1.1.3 主要仪器 |
| 1.1.4 MTB新基因重组质粒的构建 |
| 1.1.5 MTB新基因编码蛋白的表达、纯化及质谱检测 |
| 1.2 结果 |
| 1.2.1 成功构建了新基因重组表达质粒 |
| 1.2.2 部分重组质粒在四种表达载体均未实现可溶性诱导表达 |
| 1.2.3 新基因密码子优化 |
| 1.2.4 密码子优化后载体p MAL-c2X实现了高可溶性诱导表达 |
| 1.2.5 结核新基因表达融合蛋白纯化及质谱检测 |
| 1.2.6 融合蛋白洗脱液的置换 |
| 1.3 讨论 |
| 1.4 小结 |
| 第2章 结核分枝杆菌新蛋白抗原性研究及在结核病诊断中的应用初探 |
| 2.1 材料和方法 |
| 2.1.1 主要试剂 |
| 2.1.2 主要仪器和耗材 |
| 2.1.3 实验设计 |
| 2.1.4 结核分枝杆菌38kDa(Rv0934)抗原的制备 |
| 2.1.5 新抗原的B细胞表位预测 |
| 2.1.6 血清样品的收集 |
| 2.1.7 间接ELISA检测的基本步骤 |
| 2.1.8 同一批次蛋白稳定性检测 |
| 2.1.9 统计学分析 |
| 2.2 结果 |
| 2.2.1 pMAL-c2X载体标签在ELISA检测中背景干扰最小 |
| 2.2.2 38kDa重组抗原的原核克隆表达纯化 |
| 2.2.3 B细胞表位预测 |
| 2.2.4 志愿者年龄性别特征 |
| 2.2.5 ELISA抗原性检测体系稳定 |
| 2.2.6 试剂盒稳定性较好 |
| 2.2.7 筛选到具有B细胞抗原性的新编码蛋白 |
| 2.2.8 新抗原与已有抗原理论组合后具有互补性 |
| 2.3 讨论 |
| 2.4 小结 |
| 参考文献 |
| 结论 |
| 第3章 综述 结核分枝杆菌B细胞抗原的研究进展 |
| 3.1 结核分枝杆菌属特异抗原 |
| 3.1.1 38kDa抗原 |
| 3.1.2 19kDa抗原 |
| 3.1.3 16kDa抗原 |
| 3.1.4 MTB81 |
| 3.1.5 Ag85 复合物 |
| 3.2 RD区抗原 |
| 3.2.1 ESAT-6 |
| 3.2.2 CFP-10 |
| 3.3 PE和PPE蛋白家族 |
| 3.4 融合蛋白 |
| 3.5 商品化结核病血清学诊断试剂盒 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 在学期间研究成果 |
（9）新疆部分地区牛副结核病流行病学调查及抗体ELISA检测方法研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略表 |
| 第一章 文献综述 牛副结核病的研究进展 |
| 引言 |
| 1.副结核的致病机理 |
| 2.副结核病的危害 |
| 3.牛副结核病的流行现状 |
| 4.副结核病的临床症状 |
| 5.副结核病的诊断 |
| 5.1 皮下变态反应检测 |
| 5.2 细菌学检测 |
| 5.3 免疫试纸的快速诊断 |
| 5.4 分子生物学检测 |
| 5.5 酶联免疫吸附试验(ELISA) |
| 5.6 琼脂扩散实验(AGID) |
| 5.7 补体结合实验(CFT) |
| 6.副结核病的防治措施 |
| 7.研究目的及意义 |
| 第二章 实验部分 |
| 试验一 新疆不同地区牛副结核病血清学调查 |
| 1.材料和方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 血清来源 |
| 1.1.2 检测试剂盒 |
| 1.1.3 主要仪器设备 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 MAP的抗体检测的实验操作 |
| 1.2.2 阴阳性判定成立的条件 |
| 1.2.3 计算方法及结果判定标准: |
| 2.结果 |
| 3.讨论 |
| 3.1 新疆地区牛副结核病的流行情况 |
| 3.2 牛副结核病检测方法应用情况 |
| 3.3 新疆地区牛副结核病的防控措施 |
| 试验二 新疆部分地区疑似牛副结核病病例的PCR检测 |
| 1.材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 病牛的选取 |
| 1.1.2 粪便样本采集 |
| 1.1.3 引物的设计 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 调查方法 |
| 1.2.2 诊断方法 |
| 1.2.3 病料采集与处理 |
| 1.2.4 病料中总DNA的提取 |
| 1.2.5 嵌套法PCR |
| 2.结果 |
| 2.1 调查病牛的临床症状 |
| 2.2 嵌套法PCR检测结果 |
| 2.3 扩增基因序列分析 |
| 3.讨论 |
| 3.1 牛副结核病临床诊断 |
| 3.2 PCR技术优势 |
| 3.3 新疆地区临床病例鉴别诊断 |
| 实验三 牛副结核分枝杆菌(MAP)MAP3290-1595 串联蛋白的原核表达及反应原性检测 |
| 1.材料和方法 |
| 1.1 主要试剂 |
| 1.2 目的基因的获取 |
| 1.3 载体构建及质粒鉴定 |
| 1.4 MAP3290-1595 蛋白的原核表达 |
| 1.5 MAP3290-1595 蛋白的纯化 |
| 1.6 MAP3290-1595 蛋白的反应原性检测 |
| 2.结果 |
| 2.1 抗原表位分析 |
| 2.2 重组质粒pET30a-MAP3290-1595 的鉴定结果 |
| 2.3 重组质粒载体pET30a-MAP3290-1595 的诱导表达 |
| 2.4 MAP3290-1595 蛋白纯化 |
| 2.5 MAP3290-1595 重组蛋白的鉴定 |
| 2.6 MAP3290-1595 蛋白的反应原性检测 |
| 2.7 牛副结核病抗体ELISA检测方法的建立 |
| 3.讨论 |
| 3.1 抗原蛋白的选取 |
| 3.2 原核表达体系的优点 |
| 3.3 ELISA检测方法的难度 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 作者简介 |
| 致谢 |
| 附件 |
（10）结核分枝杆菌毒素—抗毒素系统mt-PemIK功能和作用机制的研究（论文提纲范文）
| 缩略词表 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 第一章 前言 |
| 1.1 结核病的历史及现状 |
| 1.2 结核分枝杆菌病原生物学 |
| 1.3 结核病发病机制 |
| 1.4 结核分枝杆菌的毒素-抗毒素系统 |
| 1.4.1 结核分枝杆菌毒素-抗毒素系统概述 |
| 1.4.2 结核分枝杆菌毒素-抗毒素系统与持留的相关性 |
| 1.4.3 结核分枝杆菌毒素-抗毒素系统的MazEF家族 |
| 1.4.4 结核分枝杆菌毒素-抗毒素系统Maz EF家族mt-PemIK |
| 1.5 本课题的研究目的及意义 |
| 第二章 结核分枝杆菌毒素-抗毒素系统mt-PemIK的鉴定 |
| 引言 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 菌株和质粒 |
| 2.1.2 实验相关试剂 |
| 2.1.3 主要溶液配制 |
| 2.1.4 主要仪器设备 |
| 2.1.5 实验中的主要引物 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 制备感受态并转化 |
| 2.2.2 耻垢分枝杆菌的培养 |
| 2.2.3 重组质粒的构建 |
| 2.2.4 重组质粒的扩增 |
| 2.2.5 重组质粒的提取 |
| 2.2.6 重组质粒的保菌 |
| 2.2.7 mt-Pem K对耻垢分枝杆菌生长的测定 |
| 2.2.8 抗毒素mt-Pem I对 mt-Pem K毒性的中和实验 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.3.1 结核分枝杆菌中新TA系统mt-PemIK的发现 |
| 2.3.2 新的TA系统mt-PemIK对耻垢分枝杆菌生长影响的鉴定 |
| 2.3.3 新的TA系统抗毒素mt-Pem I对 mt-Pem K毒性的中和 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 结论 |
| 第三章 H37Rv△Pem K敲除株的构建及野生株与敲除株生存能力的鉴定 |
| 引言 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.1.1 菌株和质粒 |
| 3.1.2 实验相关试剂 |
| 3.1.3 主要溶液配制 |
| 3.1.4 主要仪器设备 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 结核分枝杆菌H37Rv与敲除株的培养 |
| 3.2.2 结核分枝杆菌感受态细胞的制备 |
| 3.2.3 电击法转化结核分枝杆菌感受态细胞 |
| 3.2.4 CTAB法提取结核分枝杆菌DNA |
| 3.2.5 PCR扩增野生株和H37Rv△Pem K敲除株的DNA |
| 3.2.6 DNA扩增产物切胶回收 |
| 3.2.7 甲醇裂解法提取结核分枝杆菌总RNA |
| 3.2.8 总RNA质量鉴定 |
| 3.2.9 RT-PCR反转录合成c DNA |
| 3.2.10 实时荧光定量PCR检测mt-PemIK表达变化 |
| 3.2.11 结核分枝杆菌野生株与敲除株抗酸染色 |
| 3.2.12 野生株与敲除株生长的测定 |
| 3.2.13 不同条件下生长曲线的测定 |
| 3.2.14 统计分析 |
| 3.3 实验内容 |
| 3.3.1 噬菌体介导的H37Rv△Pem K敲除株构建原理 |
| 3.3.2 PCR扩增待敲除基因mt-Pem K的左右臂 |
| 3.3.3 构建噬菌粒 |
| 3.3.4 构建分枝杆菌噬菌体 |
| 3.3.5 噬菌体介导的结核分枝杆菌H37RvΔPem K敲除株的构建 |
| 3.4 实验结果 |
| 3.4.1 两段式法PCR扩增野生株与敲除株的左右臂 |
| 3.4.2 PCR及测序验证敲除株 |
| 3.4.3 实时荧光定量PCR验证敲除株 |
| 3.4.4 野生株和敲除株的抗酸染色 |
| 3.4.5 野生株与敲除株在不同条件下的生长情况 |
| 3.5 讨论 |
| 3.6 结论 |
| 第四章 细胞感染模型的构建及野生株与敲除株毒力分析 |
| 引言 |
| 4.1 实验材料 |
| 4.1.1 细胞 |
| 4.1.2 菌株 |
| 4.1.3 实验相关试剂 |
| 4.1.4 主要溶液配制 |
| 4.1.5 主要仪器设备 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 RAW264.7细胞培养 |
| 4.2.2 结核分枝杆菌的培养 |
| 4.2.3 野生株与敲除株细胞感染模型的构建 |
| 4.2.4 ELISA定量检测细胞因子 |
| 4.2.5 流式细胞术检测细胞凋亡 |
| 4.2.6 统计分析 |
| 4.3 实验结果 |
| 4.3.1 RAW264.7细胞培养 |
| 4.3.2 巨噬细胞感染后的吞噬情况 |
| 4.3.3 在巨噬细胞内的存活情况 |
| 4.3.4 巨噬细胞培养上清细胞因子水平 |
| 4.3.5 巨噬细胞凋亡检测结果 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 结论 |
| 第五章 动物感染模型的构建及野生株与敲除株对小鼠致病性分析 |
| 引言 |
| 5.1 实验材料 |
| 5.1.1 实验动物 |
| 5.1.2 菌株 |
| 5.1.3 实验动物房 |
| 5.1.4 实验相关试剂 |
| 5.1.5 主要仪器设备 |
| 5.2 实验方法 |
| 5.2.1 结核分枝杆菌野生株与敲除株感染小鼠模型的构建 |
| 5.2.2 ELISA定量检测小鼠血清细胞因子 |
| 5.2.3 统计分析 |
| 5.3 实验结果 |
| 5.3.1 小鼠的一般情况 |
| 5.3.2 小鼠肺脏和脾脏大体观 |
| 5.3.3 小鼠肺脏和脾脏的HE染色和抗酸染色 |
| 5.3.4 小鼠肺脏和脾脏CFU计数结果 |
| 5.3.5 小鼠血清细胞因子水平 |
| 5.4 讨论 |
| 5.5 结论 |
| 参考文献 |
| 文献综述 结核分枝杆菌毒素-抗毒素系统与持留相关性的研究进展 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 攻读学位期间发表论文情况 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
四、血清稀释度对ELISA法检测结核病人血清抗体结果的影响（论文参考文献）
- [1]江苏睢宁县2018-2020年奶牛布鲁氏菌病、结核病流行病学调查及综合防控技术示范[D]. 王冰清. 扬州大学, 2021
- [2]新疆汉族人群结核分枝杆菌免疫优势Th表位的筛选与鉴定[D]. 刘静. 石河子大学, 2021(02)
- [3]类鼻疽菌Hcp1及外膜多糖的制备与免疫学性质研究[D]. 章美娟. 中国人民解放军陆军军医大学, 2021(02)
- [4]基于PLD蛋白的伪结核棒状杆菌抗体间接ELISA检测方法的建立及初步应用[D]. 尹峥. 西北农林科技大学, 2021
- [5]结核分枝杆菌ESAT-6的免疫学特性及其在黏膜疫苗中的应用[D]. 宁唤唤. 西北大学, 2021(12)
- [6]牛结核病诊断技术的建立与初步应用[D]. 杨航. 石河子大学, 2020(01)
- [7]六种结核菌蛋白抗原的诊断价值及UspC蛋白的抗原性研究[D]. 李娜. 中国疾病预防控制中心, 2020(03)
- [8]结核分枝杆菌新基因编码蛋白抗原性研究及其在结核病诊断中的应用初探[D]. 王红. 华北理工大学, 2020(02)
- [9]新疆部分地区牛副结核病流行病学调查及抗体ELISA检测方法研究[D]. 张哲. 石河子大学, 2020(08)
- [10]结核分枝杆菌毒素—抗毒素系统mt-PemIK功能和作用机制的研究[D]. 常蕴青. 北京市结核病胸部肿瘤研究所, 2020(01)