家蚕BR-C新靶标基因的鉴定及功能初探

论文摘要

昆虫生长与发育受蜕皮激素（20-hydroxyecdysone,20E）和保幼激素（Juvenile hormone,JH）的协同调控。转录因子BR-C是昆虫20E信号通路中的关键作用因子之一。研究表明,BR-C是20E的初级应答基因,主要在昆虫幼虫期蜕皮和幼虫向蛹转变时发挥作用。目前,关于昆虫BR-C对20E信号的传导作用及BR-C的翻译后磷酸化修饰对其转录调控活性的影响已研究得较为清楚。但是,有关BR-C直接调控的下游靶基因的鉴定研究相对薄弱,目前已知的少数几个靶基因主要包括表皮蛋白基因和卵黄蛋白原基因。因此,鉴定昆虫BR-C的新靶基因,无疑将有助于解析BR-C的新功能及分子作用网络。本研究中,我们以家蚕BR-C为研究对象,采用高通量的染色质免疫共沉淀测序（ChIP-seq）技术在全基因组范围内对家蚕BR-C的新靶标基因进行了筛选,在分子、细胞和个体水平上系统分析了BR-C对新靶标基因转录的调控机制,初步探索了新靶标基因在家蚕生长发育过程中的功能。获得的主要结果如下:1.家蚕BR-C新靶标基因的ChIP-seq筛选我们采用ChIP-seq方法在全基因组水平鉴定筛选家蚕BR-C的潜在下游靶基因。根据ChIP-seq技术原理,我们将过表达家蚕BR-C的家蚕BmE细胞固定并通过超声破碎法将细胞基因组打断至200-1,000 bp大小的DNA片段,再利用BR-C特异性抗体沉淀BR-C与基因组DNA结合形成的复合物,最后回收基因组DNA片段并进行高通量测序。分析序列数据显示,我们在家蚕BR-C的免疫沉淀产物中共获得16,477,790 raw reads和16,455,296 clean reads,在未进行BR-C免疫沉淀的input对照组中共获得16,297,532 raw reads和16,281,588 clean reads（NCBI accession number:PRJNA518741）。通过与对照组比较,我们在BR-C免疫沉淀物中共鉴定到1,006个特异性ChIP peaks。其中,63%的ChIP peak定位于基因间区,15%定位于转录起始位点上游3.0 kb的启动子区,18%和3%分别定位于内含子和外显子区,其余的则定位于基因下游。应用MEME Suite程序对家蚕BR-C的ChIP peaks所对应且含BR-C结合基序的DNA序列进行分析,共富集到5条BR-C结合序列。基于Tomtom程序分析发现,定位于启动子区或者非启动子区的BR-C结合序列与部分锌指转录因子的识别序列类似。进一步的基因组比对发现,家蚕BR-C的1,006个ChIP peak在基因组上与829个蛋白编码基因关联。GO富集分析显示,这829个基因在生物学过程方面主要参与生物合成、物质代谢、核糖体生物发生、发育进程、自噬、细胞通讯和蛋白质折叠等生物学过程;在分子功能方面,大多数基因的功能主要集中于催化活性、结合和结构组成等。2.家蚕BR-C新靶标基因的鉴定鉴于转录因子一般是通过结合到靶基因启动子区的特异基序来启动靶基因的转录,因此我们重点关注了潜在启动子区含家蚕BR-C的ChIP peak的基因。结果显示,829个基因中有133个基因的启动子区含BR-C ChIP peak。由于BR-C主要在昆虫变态发育期高表达,我们进一步利用家蚕变态发育期间脂肪体的转录组数据对这133个基因的表达特征进行了分析,发现有76个基因在家蚕变态期脂肪体中表达;值得注意的是,有25个基因在家蚕变态发育期间的表达变化趋势与BR-C的一致,包括核受体HR96基因（BMgn010782）、保幼激素酯酶基因（JHE,BMgn000776）和鸟苷酸环化酶基因（GC-α1,BMgn009300）等。进一步的qRT-PCR实验结果显示,在家蚕变态发育期的脂肪体中,HR96和GC-α1与BR-C的表达特征一致,均在预蛹期高表达,而JHE的表达则在上簇初期最高;在翅原基中,HR96、GC-α1、JHE与BR-C的表达变化趋势基本一致。因此,我们推测HR96、GC-α1和JHE是家蚕BR-C的下游靶基因。我们进一步分析了家蚕BR-C对下游潜在靶基因启动子的结合特性与活性影响。根据靶基因启动子区BR-C ChIP peak的位置及序列信息设计特异性引物进行ChIP-PCR实验及凝胶阻滞分析（EMSA）,结果证明BR-C可与HR96、GC-α1和JHE基因的启动子区直接结合。我们进一步克隆了这3个基因的启动子并在家蚕BmE细胞中开展了双荧光素酶报告基因实验。结果显示,与对照相比,BR-C过表达显著上调HR96和GC-α1基因启动子的活性,但不影响JHE启动子的活性;当删除HR96和GC-α1启动子区BR-C的结合位点时,BR-C丧失了对靶基因的转录激活活性。以上结果表明,BR-C转录因子通过与HR96和GC-α1基因启动子区的直接结合来促进其转录表达。3.家蚕BR-C靶基因HR96的功能初探我们利用瞬时RNAi实验探究了家蚕BR-C下游靶基因HR96在变态发育过程中的功能。根据RNAi的实验原理,我们针对家蚕BR-C和HR96基因设计合成了特异的双链RNA,分别在上簇时期注射家蚕。qRT-PCR实验结果表明,注射双链RNA后24h,BR-C和HR96的mRNA水平均显著下调,表明靶基因的瞬时RNAi得以实现;与作为对照的红色荧光蛋白基因RFP的RNAi相比,BR-C基因的RNAi抑制了HR96基因的mRNA转录表达,表明HR96确实是BR-C的下游靶标基因。进一步的表型分析显示,BR-C和HR96基因的RNAi导致家蚕在幼虫上簇期死亡或化蛹异常而死亡,两者的比例分别为61.54%和47.82%。考虑到HR96与脂代谢有关,我们继而通过尼罗红（Nile Red）染色实验分析了BR-C和HR96基因RNAi对家蚕变态发育时期脂代谢的影响,发现BR-C和HR96基因RNAi后脂肪体细胞内的脂滴变小和减少。综合分析表明,家蚕BR-C转录因子通过与靶基因HR96启动子的直接结合来促进HR96的转录表达,进而调节家蚕变态发育时期的脂代谢过程。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第1章 文献综述
•   1.1 昆虫BR-C转录因子介导20E和 JH的信号转导
•   1.2 昆虫BR-C转录因子的功能
•   1.3 昆虫BR-C转录因子下游靶基因的鉴定及作用机制研究
•     1.3.1 昆虫BR-C转录因子下游靶基因的鉴定研究
•     1.3.2 昆虫BR-C蛋白的翻译后修饰调节其转录调控活性
•   1.4 ChIP-seq原理与应用
•     1.4.1 ChIP-seq的原理
•     1.4.2 ChIP-seq的应用
• 第2章 引言
•   2.1 研究背景及目的意义
•   2.2 研究内容
•     2.2.1 家蚕BR-C新靶标基因的ChIP-seq筛选
•     2.2.2 家蚕BR-C新靶标基因的鉴定
•     2.2.3 家蚕BR-C靶基因HR96 的功能初探
•   2.3 技术路线
• 第3章 家蚕BR-C新靶标基因的ChIP-seq筛选
•   3.1 材料与方法
•     3.1.1 实验材料
•     3.1.2 实验试剂及仪器
•     3.1.3 主要溶液及配制
•     3.1.4 实验方法
•   3.2 实验结果与分析
•     3.2.1 家蚕BR-C转录因子ChIP-seq的样品检测
•     3.2.2 家蚕BR-C转录因子ChIP-seq数据质量统计分析
•     3.2.3 家蚕BR-C转录因子ChIP peak的基因组分布及Motif鉴定
•     3.2.4 家蚕BR-C潜在靶基因的GO注释
•   3.3 讨论
• 第4章 家蚕BR-C新靶标基因的鉴定
•   4.1 材料与方法
•     4.1.1 实验材料
•     4.1.2 实验试剂及仪器
•     4.1.3 主要溶液及配制
•     4.1.4 实验方法
•   4.2 实验结果与分析
•     4.2.1 基于转录组数据的家蚕BR-C新靶标基因的鉴定分析
•     4.2.2 家蚕BR-C候选靶基因在变态发育过程中的表达变化
•     4.2.3 家蚕BR-C与候选靶基因启动子的直接结合
•     4.2.4 家蚕BR-C促进候选靶基因启动子的活性
•   4.3 讨论
• 第5章 家蚕BR-C靶基因HR96 的功能初探
•   5.1 材料与方法
•     5.1.1 实验材料
•     5.1.2 实验试剂及仪器
•     5.1.3 主要溶液配制
•     5.1.4 实验方法
•   5.2 实验结果与分析
•     5.2.1 家蚕BR-C与 HR96 基因的RNAi
•     5.2.2 家蚕BR-C和 HR96 基因RNAi导致化蛹异常
•     5.2.3 家蚕BR-C和 HR96 基因RNAi影响脂代谢过程
•   5.3 讨论
• 第6章 综合与讨论
• 参考文献
• 附录
• 硕士期间发表论文及参研课题
• 致谢

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 郭梦佩

导师: 程道军

关键词: 家蚕,转录因子,靶基因,功能

来源: 西南大学

年度: 2019

分类: 基础科学

专业: 生物学

单位: 西南大学

分类号: Q963

总页数: 79

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