禽腺病毒血清4型巢式PCR和环介导等温扩增检测方法建立及应用

论文摘要

2015年6月起,由禽腺病毒血清4型（Fowl adenovirus serotype 4,FAdV-4）引起的以心包积聚淡黄色液体、肝炎和肾炎为主要临床特征的新型家禽传染性疾病——心包积水-肝炎综合征（Hydropericardium hepatitis syndrome,HHS）在我国山东、安徽、江苏、河南等省份大面积流行。该病易发生混合感染,主要危害36周龄的肉鸡,死亡率最高可达90%,给家禽养殖业带来重大的经济损失。常规实验室检测方法需要特殊的仪器设备,仪器价格昂贵而且检测场地受到限制,检测耗时费力,在基层生产过程中存在诸多不便,所以建立一种快速、灵敏、便捷的检测方法十分必要。本研究建立了巢式PCR和环介导等温扩增（Loop-mediated isothermal amplification,LAMP）两种方法用于检测FAdV-4。通过对GenBank上已公布的27株禽腺病毒全基因序列进行比对,针对其高度保守区域设计特异性的分别针对I群禽腺病毒和FAdV-4的2对巢式PCR引物,建立了一种FAdV-4巢式PCR检测方法,并对该方法的反应条件以及反应体系进行优化。巢式PCR优化后反应条件为:第一轮反应最佳退火温度为60.4℃,退火时间35 s,循环30次,外引物浓度为0.9μmol/L,Mg2+浓度为2.5 mmol/L,rTaq DNA聚合酶浓度为1 U;第二轮反应最佳退火温度为54.6℃,退火时间30 s,循环30次,内引物浓度为0.5μmol/L,Mg2+浓度为1.0 mmol/L,rTaq DNA聚合酶浓度为1 U。该检测方法优化后呈现最高效率的特异性扩增,未见与其他鸡源易感病毒发生交叉反应,同时该检测方法具有较高的灵敏度,最低可检测到5.2 pg/μL的病毒DNA。同时,针对FAdV-4 Hexon基因序列设计了特异性LAMP引物,建立了一种对FAdV-4的LAMP检测方法,并对其反应条件和反应体系进行优化。优化后反应温度为62℃,反应时间为30 min,当外引物与内引物浓度之比为1:2时,扩增效果显著提升。当Mg2+浓度为6.0μmol/L时显示当前最好扩增效果。灵敏性试验结果显示该方法比巢式PCR检测方法灵敏度高出10倍,同时具有良好的特异性。最后运用两种检测方法同时对102份临床样本进行检测,LAMP检测方法检出的阳性率为34.3%,巢式PCR方法检出的阳性率为20.5%,说明LAMP检测方法更特异灵敏而有较好的应用前景。

论文目录

• 摘要
• 英文摘要
• 1 前言
•   1.1 禽腺病毒概述
•     1.1.1 禽腺病毒分类
•     1.1.2 禽腺病毒形态学特征
•     1.1.3 禽腺病毒基因结构
•     1.1.4 禽腺病毒理化特性
•   1.2 禽腺病毒血清4型流行病学研究
•   1.3 禽腺病毒血清4型感染的临床症状和病理变化
•     1.3.1 临床症状
•     1.3.2 尸体剖检变化
•     1.3.3 病理组织病理变化
•   1.4 禽腺病毒实验室诊断方法
•     1.4.1 临床病理诊断
•     1.4.2 病毒分离和鉴定
•     1.4.3 病毒的电镜观察
•     1.4.4 血清学诊断方法
•     1.4.5 分子生物学诊断方法
•   1.5 防治措施
•   1.6 研究的目的与意义
• 2 材料与方法
•   2.1 材料
•     2.1.1 试验动物及病毒
•     2.1.2 试验药品试剂
•     2.1.3 仪器设备
•   2.2 FAdV-4 巢式PCR检测方法的建立和优化
•     2.2.1 FAdV-4在SPF鸡胚内的增殖培养
•     2.2.2 引物设计与合成
•     2.2.3 病毒核酸的提取
•     2.2.4 巢式PCR检测方法的初步建立
•     2.2.5 巢式PCR检测方法的优化
•     2.2.6 巢式PCR方法特异性试验
•     2.2.7 巢式PCR方法敏感性试验
•     2.2.8 巢式PCR方法重复性试验
•     2.2.9 临床样本检测
•   2.3 FAdV-4 环介导等温扩增技术检测方法的建立和优化
•     2.3.1 引物设计与合成
•     2.3.2 LAMP检测体系的初步建立
•     2.3.3 LAMP检测条件的优化
•     2.3.4 LAMP检测方法特异性试验
•     2.3.5 LAMP检测方法敏感性试验
•     2.3.6 临床样本检测
• 3 结果与分析
•   3.1 FAdV-4 巢式PCR检测方法的建立和优化
•     3.1.1 病毒基因序列的比对
•     3.1.2 巢式PCR检测方法的初步建立
•     3.1.3 巢式PCR检测最佳反应条件的确立
•     3.1.4 巢式PCR方法特异性试验
•     3.1.5 巢式PCR方法敏感性试验
•   3.2 FAdV-4 环介导等温扩增技术检测方法的建立及应用
•     3.2.1 LAMP检测体系的初步建立
•     3.2.2 LAMP反应最佳条件的确定
•     3.2.3 LAMP检测方法特异性试验
•     3.2.4 LAMP检测FAdV-4 的灵敏度试验
•     3.2.5 临床样本检测结果
• 4 讨论
•   4.1 FAdV-4巢式PCR检测方法和分析
•   4.2 FAdV-4 LAMP检测方法和分析
• 5 结论
• 致谢
• 参考文献
• 攻读硕士学位期间发表的学术论文

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 钟鸣

导师: 李广兴,王积海

关键词: 禽腺病毒,巢式,环介导等温扩增,敏感性,特异性

来源: 东北农业大学

年度: 2019

分类: 基础科学,农业科技

专业: 生物学,畜牧与动物医学

单位: 东北农业大学

分类号: S852.65

总页数: 59

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