论文摘要
小反刍兽疫（Peste des petits ruminants,PPR）是由小反刍兽疫病毒（Peste des petits ruminants virus,PPRV）引起的一种急性烈性以及高度接触性传染病。该病2007年在我国西藏首次发生,2014年先后在青海、宁夏、甘肃、内蒙、山东、辽宁、湖南等省市自治区暴发,造成了巨大的经济损失。PPRV对淋巴细胞和上皮细胞具有较强嗜性,主要侵害淋巴组织、呼吸系统、消化系统和生殖系统,导致急性发热、肠炎、支气管肺炎和怀孕母羊流产等症状,但其潜在的致病机制仍不清楚。细胞自噬是一种溶酶体依赖性的降解途径,在维持细胞内环境稳定的过程中发挥重要作用。细胞自噬一方面缓解细胞对抗不利应激和刺激,确保细胞更新和物质再利用;另一方面自噬及其双层膜结构会被一些病原微生物利用并且作为其复制场所。为了探究PPRV感染宿主细胞后胞内分子的变化及其与自噬的关系,本文从以下几个方面展开研究:（1）PPRV感染山羊子宫内膜上皮细胞后差异表达基因的筛选与分析。本研究通过DNA芯片检测分析PPRV Nigeria 75/1毒株感染山羊子宫内膜上皮细胞（EECs）后胞内基因的表达规律,探究PPRV感染宿主细胞1 h和24 h后引发的细胞反应。结果显示,与对照组相比,PPRV感染1 h共筛选到85个上调的差异表达基因,61个下调的差异表达基因。其中,NFκBIA、JUNB和IL-1等基因之前并没有被报道过与PPRV感染相关。与PPRV感染1 h相比,PPRV感染24 h共筛选到307个上调的差异表达基因,261个下调的差异表达基因。Pathway分析发现这些差异基因主要参与抑炎反应、细胞周期、mTOR信号通路、凋亡信号通路、MAPK信号通路等。基因网络分析显示13个基因（EIF2AK3、IL-10、TLR4、ZO3、NFκBIB、RAC1、HSP90AA1、SMAD7、ARG2、JUNB、ZFP36、APP和IL-1）位于差异基因网络的核心位置。通过荧光定量PCR的方法对TNF、NFκBIB、IL-1、TLR4等差异基因进行了验证,确定了高通量测序的准确性。此外,研究表明PPRV感染EECs后显著上调Nectin-4受体的表达并且使Nectin-4分子向细胞膜聚集。该部分研究首次筛选得到了PPRV侵染EECs过程中差异表达的胞内基因,为病毒入侵以及早期感染机制提供相关的理论基础及科学依据。（2）PPRV诱导EECs自噬对病毒复制的影响。本研究通过透射电镜、免疫印迹等方法,发现PPRV感染EECs后能够增加单层和双层自噬体样膜囊泡的数量以及LC3-II的表达量,说明PPRV可以诱导宿主细胞自噬的发生。此外,PPRV感染EECs后还能够增加p62的降解,然而E64d可以造成p62的升高和LC3-II的堆积,说明PPRV感染可以引发完全自噬反应。为了分析各种病毒功能蛋白对细胞自噬的影响,我们分别用含有病毒N、F、C、H和V基因的质粒转染EECs,结果显示,HA-N、HA-C和HA-H蛋白显著增加了EECs中LC3-II的表达并且与LC3发生共定位,说明PPRV的N、C、H蛋白在诱导细胞自噬的过程中均发挥了重要作用。为了进一步分析细胞自噬在PPRV复制中的作用,我们利用Rapamycin、NH4Cl、Chloroquine、Wortmannin以及干扰ATG7和Beclin-1的shRNA促进或抑制细胞自噬后,对PPRV的病毒滴度以及N蛋白的表达进行了检测。结果表明,Rapamycin诱导的自噬能够促进PPRV的复制,而NH4Cl、Chloroquine、Wortmannin以及干扰ATG7和Beclin-1所抑制的自噬均会降低PPRV的复制。另外研究发现,干扰ATG7和Beclin-1的表达以及Wortmannin处理抑制自噬体形成能够促进PPRV诱导的Caspase依赖的细胞凋亡。然而,NH4Cl和Chloroquine抑制自噬体与溶酶体融合不会增加凋亡细胞的数量以及Caspase的活性。以上结果表明,PPRV诱导的自噬抑制Caspase依赖的细胞凋亡,有助于增强病毒在宿主细胞中的复制。（3）PPRV诱导EECs持续自噬的分子机制。本研究对PPRV感染EECs后0 h、1.5 h、3 h、6 h、9 h、12 h和24 h的LC3-II、p62进行检测,发现在PPRV感染EECs 1.5h即可增加EECs自噬体的数量以及LC3-II的表达,并且下调了AKT和mTOR的磷酸化,说明PPRV进入细胞时通过抑制AKT和mTOR的活性诱导第一波自噬的发生。另外,在PPRV感染早期阶段,干扰Nectin-4的EECs中p-AKT和p-mTOR水平显著上升,说明受体Nectin-4是PPRV感染早期诱导第一波自噬的关键蛋白。进一步研究发现,病毒蛋白H与Nectin-4结合是抑制AKT和mTOR磷酸化从而诱导第一波自噬的必要条件,说明自噬是细胞用于抵御病毒入侵的关键途径。第一波自噬维持时间较短,PPRV感染EECs 3 h即恢复到基础水平。随着病毒的复制,IRGM和HSP70的蛋白水平显著升高,在PPRV感染EECs 9 h后诱导了第二波自噬并且持续的产生。进一步研究发现,病毒C蛋白与IRGM或N蛋白与HSP70能够发生相互作用,并且在EECs中共定位。干扰IRGM和HSP70的EECs中LC3-II的表达以及自噬体点状聚集的数量显著减少,说明C蛋白与IRGM或N蛋白与HSP70的互作是PPRV通过IRGM-HSP70依赖性途径诱导自噬的关键因素。此外,EECs合胞体的形成是持续的细胞自噬和PPRV有效复制的必要条件。综上所述,本研究利用基因芯片技术筛选得到了PPRV感染EECs后差异表达的胞内基因,为PPRV与宿主细胞互作关系提供了理论基础。进一步阐明PPRV感染EECs后能够诱导细胞自噬的发生,并且发现PPRV可以利用自噬抑制细胞凋亡促进自身复制的现象。揭示了PPRV诱导EECs自噬的过程中Nectin-4、HSP70、IRGM与病毒蛋白互作的分子机制,为小反刍兽疫在疫苗防控与治疗方面提供重要的靶点。
论文目录
文章来源
类型: 博士论文
作者: 杨勃
导师: 王晶钰
关键词: 小反刍兽疫病毒,基因芯片,细胞自噬,病毒复制
来源: 西北农林科技大学
年度: 2019
分类: 基础科学,农业科技
专业: 生物学,畜牧与动物医学
单位: 西北农林科技大学
基金: 国家自然科学基金项目(No.31602035),国家重点研发计划(2017YFD0500902)
分类号: S852.65
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