大豆生育期基因TOF7的图位克隆和功能分析

论文摘要

生育期（特别是开花期）是影响大豆品种分布和产量的重要因素之一,大豆生育期调控基因的挖掘和研究,对选育生态适应性广的优良大豆品种至关重要。迄今,诸多调控大豆生育期的E系列基因已被克隆,它们的应用提高了育种效率和产量,但仍未完全解决育种问题。因此,本试验旨在图位克隆新的生育期基因,并进行功能分析,进一步为大豆适应性和产量的提高提供理论依据。具体研究内容如下:1.利用Minsoy（Ele2e3E4）和Archer（elase2E3E4）杂交后构建的MA重组自交系进行长日照条件下开花期QTL检测。通过亲本重测序和MA群体SLAF-seq,共开发了 5,074个分子标记,构建出总长度为3,588.94cM的高密度遗传图谱。结合F6代和F8代MA群体的花期表型,检测到三个稳定遗传的花期QTL（TOF5、TOF6.和和TOF7）,分别位于5号、6号和7号染色体上。其中TOF61与E1基因所在基因组位点重合,且E1在本群体中有分离,故TOF6.1可能是E1基因。TOF7对花期贡献率仅次于TOF6.1,其编码基因未见报道。所以,TOF7是一个新花期位点。2.利用MA群体的7号染色体遗传图谱和两年的花期数据,将TOF7粗定位在Chr7:3904858和Chr7:4936114之间,约1.03Mb内,并筛选到该区间的剩余片段杂合系（Residual heterozygous lines,RHLs）,#13 和#131。通过对 RHLs#13和#131的花期和生育期鉴定,这2个家系F2后代均呈现出3:1的分离比例,且F3后代均符合1:2:1的分离比,表明TOF7位点由单基因控制。利用TOF7位点的近等基因系（Near-isogenic lines,NILs）,NIL-TOF7 植株比 NIL-tof7 的花期和生育期明显提前,说明TOF7基因控制早花早熟。进一步精细定位,TOF7位点缩小到约138kb区间内,并鉴定到TOF7的候选基因为一个拟南芥光周期调控开花途径中关键生物钟基因的同源基因。3.通过基因序列分析,TOF7基因CDS区在亲本间存在非同义碱基差异,且该碱基变异使编码蛋白N端核定信号区的第9位氨基酸发生置换。进而对目的蛋白进行亚细胞定位,亲本Minsoy中TOF7蛋白主要定位于细胞核中;而亲本Archer中tof7蛋白则定位于细胞质和细胞核中。拟南芥功能互补实验显示,亲本Minsoy中的TOF7可回补拟南芥同源基因突变体的早花早熟表型,而亲本Archer中的候选基因则不能。利用CRISPR-cas9基因编辑技术,将TOF7基因碱基缺失突变后,与野生型植株（Wild-Type,WT）相比,长日照条件下突变体明显推迟开花5-6天,生育期延长约15天。这些结果充分证明了 TOF7基因的非同义突变导致蛋白亚细胞定位变化而形成晚花和晚熟。此外,NIL-tof7和突变株tof7分别比NIL-TOF7和WT的单株产量高,这说明TOF7对育种的重要性。4.TOF7基因呈现24h生物钟节律表达,且主要在大豆三重复叶中表达。在大豆光周期调控花期的信号途径中,TOF7基因通过抑制El基因的表达,进而上调GmFT2a和GmFT5a基因的表达,致使开花提前。这些结果将补充大豆生物钟基因调控开花方面的研究。综上所述,本研究是以QTL定位为基础,图位克隆到一个新的、主要的花期调控基因TOF7。通过亚细胞定位、功能互补及突变体等多种方法,证明了TOF7控制早花早熟,并参与到大豆E1-E4构成的生育期调控网络中。本研究将促进大豆光周期调控生育期途径的深入认知,为大豆品种的适应性和分子育种提供有力的理论依据。

论文目录

• 摘要
• abstract
• 第1章 引言
•   1.1 选题背景与意义
•   1.2 国内外研究进展
•     1.2.1 植物开花途径
•     1.2.2 植物光周期调控开花的分子机理
•     1.2.3 大豆开花期调控网络的研究进展
• 第2章 大豆开花期QTL的定位
•   2.1 材料与方法
•     2.1.1 供试材料
•     2.1.2 田间试验设计
•     2.1.3 表型数据统计
•     2.1.4 MA群体遗传图谱的构建
•     2.1.5 开花期QTL检测
•     2.1.6 产量相关性状QTL检测
•   2.2 结果与分析
•     2.2.1 MA重组自交系的构建
•     2.2.2 大豆遗传图谱的建立
•     2.2.3 MA重组自交群体的花期分析
•     2.2.4 其他产量相关性状QTL的定位
•   2.3 本章小结
• 第3章 大豆开花期基因TOF7的图位克隆
•   3.1 材料与方法
•     3.1.1 实验材料与试剂
•     3.1.2 田间试验设计
•     3.1.3 表型数据统计
•     3.1.4 TOF7位点的确定
•     3.1.5 TOF7的精细定位
•     3.1.6 TOF7的候选基因
•   3.2 结果与分析
•     3.2.1 TOF7位点的定位
•     3.2.2 TOF7位点由单基因控制
•     3.2.3 TOF7基因的精细定位
•     3.2.4 TOF7的候选基因
•     3.2.5 TOF7促进早花和早熟
•     3.2.6 TOF7ILs的产量表型分析
•   3.3 本章小结
•     3.3.1 TOF7基因的精细定位
•     3.3.2 TOF7的候选基因
• 第4章 TOF7基因的功能分析
•   4.1 材料与方法
•     4.1.1 实验材料与种植条件
•     4.1.2 TOF7蛋白的聚类分析及结构预测
•     4.1.3 TOF7蛋白的亚细胞定位
•     4.1.4 TOF7基因的功能互补分析
•     4.1.5 TOF7突变体载体的构建
•     4.1.6 大豆遗传转化
•     4.1.7 TOF7突变体的获得
•     4.1.8 qRT-PCR实验
•     4.1.9 转录组测序
•     4.1.10 TOF7基因的自然变异鉴定
•   4.2 结果与分析
•     4.2.1 TOF7蛋白序列比对
•     4.2.2 TOF7蛋白高级结构预测
•     4.2.3 TOF7蛋白的亚细胞定位分析
•     4.2.4 TOF7基因的功能互补分析
•     4.2.5 TOF7突变体的表型分析
•     4.2.6 TOF7基因的表达模式分析
•     4.2.7 TOF7基因与E1-E4的关系
•     4.2.8 转录组测序结果
•     4.2.9 TOF7基因自然变异分析
•   4.3 本章小结
•     4.3.1 TOF7蛋白序列分析
•     4.3.2 TOF7基因促进开花
•     4.3.3 TOF7调控开花的分子机制
• 第5章 结论与讨论
•   5.1 大豆花期调控新位点TOF7的图位克隆
•     5.1.1 TOF7基因的初定位
•     5.1.2 TOF7基因的精细定位
•   5.2 大豆花期调控新位点TOF7的功能分析
•     5.2.1 TOF7基因对花期的影响
•     5.2.2 大豆开花调控网络的进展
•   5.3 大豆花期基因在育种上的应用
•     5.3.1 TOF7基因与产量的关系
•     5.3.2 大豆生育期基因的应用
• 参考文献
• 致谢
• 作者简历及攻读学位期间发表的学术论文与研究成果

文章来源

类型: 博士论文

作者: 王飞飞

导师: 孔凡江

关键词: 花期,精细定位,功能分析,大豆

来源: 中国科学院大学(中国科学院东北地理与农业生态研究所)

年度: 2019

分类: 基础科学,农业科技

专业: 生物学,生物学,农作物

单位: 中国科学院大学(中国科学院东北地理与农业生态研究所)

分类号: S565.1;Q943.2

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