AcMNPV侵染宿主细胞的进程中Ac-PK2和BmK IT的功能和机制研究

论文摘要

苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒（Autographa california multiple nuclear polyhedrosis virus,AcMNPV）是一种模式杆状病毒,也是微生物杀虫剂。Bm K IT是一种来源于东亚钳蝎的昆虫特异性毒素蛋白,本实验室前期构建了重组杆状病毒AcMNPV-BmK IT,并发现其可以在感染早期加速宿主细胞中P53蛋白的表达,上调凋亡抑制因子p35基因的转录表达,具有更高的细胞毒性和抗虫活性。为了明确AcMNPV-BmK IT侵染宿主细胞后具体的作用机制,我们通过转录组学的方法分析了AcMNPV-BmK IT的侵染对Sf9细胞基因转录水平的影响。转录组数据的分析结果显示病毒侵染会对宿主细胞的翻译过程产生影响,因为杆状病毒侵染会激活宿主细胞中一系列的抗病毒反应,其中包括降低总蛋白的合成来抑制病毒的增殖。简而言之,病毒侵染后宿主细胞会激活eIF2α激酶来磷酸化eIF2α,抑制蛋白质翻译的起始过程,降低总蛋白的合成来抵抗病毒侵染。而AcMNPV表达的Ac-PK2蛋白可以抑制eIF2α激酶的激活,营救翻译起始。为了明确过表达Ac-PK2蛋白是否会提高AcMNPV的杀虫活性及其作用机制,本研究中我们构建了重组病毒AcMNPV-PK2-EGFP/RFP,并进行了深入的研究。在此基础上,探讨了过表达Ac-PK2蛋白的重组病毒与AcMNPV-BmK IT共侵染后抗虫活性是否具有协同效应。本研究分为四部分:第一部分转录组测序筛选AcMNPV-BmK IT侵染后Sf9细胞中的差异表达基因为分析AcMNPV-BmK IT的抗虫机制,了解AcMNPV-BmK IT侵染对Sf9细胞转录水平的影响,我们在AcMNPV和AcMNPV-BmK IT侵染72 h后提取了Sf9细胞的RNA并进行反转录,通过Solexa测序进行了转录水平的分析。三个处理组中共鉴定出61269个转录本,其中在对照组control（C）的Sf9细胞中检测到54189个转录本,在AcMNPV（AT）侵染的Sf9细胞中检测到57979个转录本,在AcMNPV-BmK IT（ABT）侵染的Sf9细胞中检测到56575个转录本。对分析到的蛋白质序列进行KOG功能分类预测,共有7711个蛋白被注释上26种KOG分类。对蛋白进行KEGG注释,其中有4874个蛋白共注释上4211个KO,2853个基因共注释上339个pathway。总共鉴定出957个差异表达基因:第一组（ABT相对AT,ABT V.S.AT）中共分析到38个表达上调的基因,135个表达下调的基因;第二组（ABT相对C,ABT V.S.C）中共分析到129个表达上调的基因,84个表达下调的基因;在最后一组（AT相对于C,AT V.S.C）中,分析到459个表达上调的基因,112个表达下调的基因。我们从这些差异表达基因中选取了11个基因进行了qPCR验证,qPCR的结果与转录组测序的结果基本一致。差异表达基因的KEGG、GO功能分析的结果显示AcMNPV和AcMNPV-BmK IT对宿主细胞中DNA复制、蛋白质翻译等细胞过程相关的基因表达有影响。文献调研发现,宿主细胞可以通过降低总蛋白合成来抵抗病毒侵染,而AcMNPV表达的Ac-PK2蛋白可以营救蛋白翻译,那么过表达Ac-PK2蛋白是否可以提高AcMNPV的细胞毒力和抗虫活性,我们进行了进一步的研究。第二部分AcMNPV-PK2-EGFP对宿主细胞能量代谢和子代病毒产量的影响首先,利用Bac-to-Bac昆虫杆状病毒重组表达系统构建了过表达Ac-PK2蛋白的重组病毒AcMNPV-PK2-EGFP。用5 MOI的重组病毒AcMNPV-PK2-EGFP侵染Sf9细胞,荧光显微镜观察与Western blot分析结果表明,PK2-EGFP融合蛋白表达量从24 h开始随着侵染时间的延长而逐渐增加,并在72 h达到最高水平。相较于野生型病毒AcMNPV处理组,重组病毒AcMNPV-PK2-EGFP侵染48 h后Sf9细胞内eIF2α磷酸化逐渐减少。葡萄糖消耗的检测结果发现,AcMNPV-PK2-EGFP处理组能量消耗增加,葡萄糖的消耗速率在36、48、60 h显著高于野生型病毒处理组,分别是野生型病毒处理组的1.11倍、1.2倍、1.34倍。AcMNPV-PK2-EGFP处理组培养液中乳酸积累从48 h开始显著低于野生型病毒处理组,但与未处理组无明显差异。细胞内的ATP含量在病毒侵染后48、60、72 h,即Ac-PK2蛋白开始过表达之后有一个显著的增加,分别是野生型病毒处理组的1.12倍、1.09倍、1.10倍。AcMNPV-PK2-EGFP处理组己糖激酶（hexokinase,HK）的活性在48、60 h显著高于未处理组,分别是未处理组的1.21倍、1.16倍。噬斑实验的结果显示AcMNPV-PK2-EGFP处理组在病毒侵染后48、72 h,子代病毒的产量显著高于野生型病毒处理组,缺失ac-pk2基因的重组病毒侵染会导致子代病毒的产量降低。这些结果表明重组病毒AcMNPV-PK2-EGFP的侵染可以对宿主细胞能量代谢产生影响,为子代病毒的复制产生提供更有利的环境。既然重组病毒AcMNPV-PK2-EGFP可以增加子代病毒的产量,那么AcMNPV-PK2-EGFP的侵染是否会加速宿主细胞的凋亡,我们进行了进一步的研究。第三部分AcMNPV-PK2-RFP加速宿主细胞凋亡的机制分析流式细胞术分析结果显示,重组病毒AcMNPV-PK2-EGFP侵染Sf9细胞48、72h后,细胞凋亡比例显著高于野生型病毒处理组。为研究AcMNPV-PK2-EGFP加速宿主细胞凋亡的机制,本节中我们构建了带红色荧光蛋白的过表达Ac-PK2的重组病毒AcMNPV-PK2-RFP。ROS活性检测结果显示AcMNPV-PK2-RFP处理组Sf9细胞中活性氧的水平在48、72 h显著高于野生型病毒处理组。线粒体膜电位检测发现AcMNPV-PK2-RFP处理组在病毒侵染后24、48、72 h细胞内绿色荧光的强度均高于野生型病毒处理组,说明AcMNPV-PK2-RFP处理组线粒体膜电位低于野生型病毒处理组。Western blot的结果表明AcMNPV-PK2-RFP处理组SfP53蛋白的表达在病毒侵染后48、60、72 h均显著高于野生型病毒处理组,是野生型病毒处理组的1.16倍、1.39倍、1.79倍。接着,我们通过Western blot检测了细胞色素c在线粒体和胞质的分布情况,结果显示两种病毒处理组均会影响细胞色素c的释放,相较于野生型病毒处理组而言,AcMNPV-PK2-RFP的处理组线粒体中的细胞色素c明显减少,细胞色素c的释放提前,从24 h开始逐渐增加。根据以上结果,我们推测AcMNPV和AcMNPV-PK2-RFP侵染Sf9细胞后通过刺激线粒体凋亡信号通路加速宿主细胞的凋亡,因为过表达Ac-PK2蛋白的重组病毒可以增加子代病毒的产量,新产生的子代病毒会对细胞进行二次侵染,从而加速了AcMNPV-PK2-RFP处理组线粒体凋亡途径的激活。第四部分AcMNPV-PK2-EGFP的抗虫活性及侵染甜菜夜蛾幼虫的机制分析前面两部分的实验结果表明,过表达Ac-PK2蛋白的重组病毒AcMNPVP-PK2-EGFP/RFP可以调控宿主细胞能量代谢,帮助子代病毒复制,加速宿主细胞的凋亡。那么重组病毒AcMNPVP-PK2-EGFP是否具有更高的抗虫活性?我们进行了虫体水平的实验。qPCR的结果显示重组病毒AcMNPV-PK2-EGFP侵染后可以上调Ac-pk2基因在中肠组织和神经索组织的表达,AcMNPV-PK2-EGFP与AcMNPV-BmK IT共侵染后,可以增加BmK IT在中肠组织和神经索组织的表达,并且在病毒侵染的早期,解毒相关基因sod、p450、cat的表达也会受到影响。Western blot的结果显示AcMNPV处理组和AcMNPV-BmK IT+AcMNPV处理组,eIF2α的磷酸化随着侵染时间逐渐增加,AcMNPV-PK2-EGFP处理组eIF2α的磷酸化在病毒侵染后4h达到最大值,8至12 h逐渐减少。AcMNPV-PK2-EGFP+AcMNPV-BmK IT处理组,eIF2α的磷酸化在病毒侵染后8 h达到最大值,12 h开始减少,说明相较于野生型病毒,过表达Ac-PK2蛋白的重组病毒的侵染可以减少甜菜夜蛾幼虫中肠组织eIF2a的磷酸化,有利于子代病毒的复制。同时,我们观察到各病毒处理组P53蛋白在病毒侵染1 h后开始表达,病毒侵染4、8、12 h后AcMNPV-BmK IT+AcMNPV-PK2-EGFP处理组P53蛋白的表达显著高于AcMNPV、AcMNPV-PK2-EGFP、AcMNPV-BmK IT+AcMNPV病毒处理组,说明重组病毒AcMNPV-PK2-EGFP和AcMNPV-BmK IT共处理可以加速甜菜夜蛾幼虫中肠组织细胞的凋亡。酚氧化酶活性检测的结果显示,AcMNPV-BmK IT+AcMNPV-PK2-EGFP处理组酚氧化酶活性在4 h达到最大值,分别是AcMNPV、AcMNPV-PK2-EGFP、AcMNPV-BmK IT+AcMNPV处理组4 h的1.58倍、1.25倍、1.18倍。我们统计了对照组及病毒处理组甜菜夜蛾幼虫的平均体重、致死率、蛹化率、羽化率,四个处理组甜菜夜蛾幼虫的死亡率分别为54.78%、76.6%、83.3%、90%,对应的蛹化率分别为33.3%、26.67%、20%、16.67%,羽化率分别为20%、16.67%、13.3%、10%。可以看到,相较于AcMNPV处理组,AcMNPV-PK2-EGFP处理组的幼虫致死率显著增高,蛹化率、羽化率降低,说明AcMNPV-PK2-EGFP具有更高的抗虫活性。相较于AcMNPV+AcMNPV-BmK IT处理组,AcMNPV-PK2-EGFP+AcMNPV-BmK IT处理组甜菜夜蛾幼虫的羽化时间推迟,蛹化率和羽化率均降低,最终的致死率显著提高。综合上述结果,AcMNPV-PK2-EGFP相较于野生型病毒而言具有较高的抗虫活性,AcMNPV-PK2-EGFP和AcMNPV-Bm K IT共处理会使得抗虫活性进一步升高。这部分的结果在虫体水平上解析了重组杆状病毒AcMNPV-PK2-EGFP、AcMNPV-BmK IT经口服感染后通过影响解毒相关基因（sod、p450、cat）的表达、酚氧化酶的活性,调控中肠组织eIF2α的磷酸化以及凋亡相关蛋白P53的表达来增加宿主昆虫的死亡率,明确了重组病毒AcMNPV-PK2-EGFP和AcMNPV-BmK IT抗虫活性存在协同效应。综上所述,本研究通过转录组学的方法分析了AcMNPV-Bm K IT侵染对Sf9细胞转录水平的影响,鉴定了900多个差异表达基因,并进行了qPCR验证。我们构建了过表达Ac-PK2蛋白的重组病毒AcMNPV-PK2-EGFP/RFP,在细胞水平上分析了AcMNPV侵染宿主过程中过表达Ac-PK2蛋白对宿主细胞能量代谢和子代病毒产量的影响,明确了重组病毒AcMNPV-PK2-EGFP通过影响线粒体凋亡信号通路加速宿主细胞凋亡的机制,并且在虫体水平上分析了重组病毒AcMNPV-PK2-EGFP的抗虫活性及作用机制,明确了AcMNPV-PK2-EGFP与AcMNPV-Bm K IT共侵染可以增强AcMNPV-BmK IT的抗虫活性。本研究为杆状病毒的抗虫机制研究及应用提供了实验依据,对科学防治鳞翅目害虫具有重要意义。

论文目录

中文摘要

ABSTRACT

第一章文献综述

1 杆状病毒

1.1 杆状病毒概述

1.2 杆状病毒的生活史

1.3 杆状病毒的分类

1.4 昆虫杆状病毒表达载体系统

1.5 昆虫杆状病毒作为生物杀虫剂的应用

2 重组杆状病毒研究进展

2.1 重组杆状病毒的构建策略

2.2 重组蝎昆虫毒素杆状病毒的研究进展

2.3 重组杆状病毒的安全性

3 杆状病毒与宿主细胞的互作分析

3.1 杆状病毒的siRNA抑制因子

3.2 宿主细胞的凋亡和杆状病毒的凋亡抑制因子

3.3 宿主细胞降低蛋白质合成和杆状病毒营救蛋白质翻译

3.4 宿主细胞中抗病毒相关信号通路

4 昆虫免疫的研究进展

4.1 昆虫免疫概述

4.2 昆虫的抗病毒免疫

5 杆状病毒侵染对宿主细胞能量代谢的影响

5.1 昆虫细胞能量代谢

5.2 杆状病毒侵染对昆虫细胞能量代谢的影响

6 杆状病毒pk2 基因的研究进展

6.1 ac-pk2 基因

6.2 杆状病毒pk2 基因同源性分析

6.3 杆状病毒PK2 蛋白的结构和功能

7 论文设计思路

7.1 研究内容及创新意义

7.2 实验技术流程

第二章转录组测序筛选AcMNPV-Bm K IT侵染后Sf9 细胞中的差异表达基因

1 引言

2 实验材料

2.1 细胞株和病毒株

2.2 主要实验试剂

2.3 主要仪器设备

3 实验方法

3.1 Sf9 细胞的培养

3.2 蚀斑检测

3.3 细胞处理

3.4 RNA提取和反转录

3.5 Solexa转录组测序

3.6 qPCR实验

4 实验结果

4.1 Solexa测序和原始数据质量预处理

4.2 De novo拼接和CDS预测

4.3 Unigene与公共数据库比较

4.4 Unigene的 KOG、GO、KEGG注释

4.5 表达基因的丰度分析

4.6 差异表达基因分析

4.7 qPCR验证差异表达基因

5 讨论

第三章重组杆状病毒AcMNPV-PK2-EGFP可以提高宿主细胞蛋白质合成并影响能量代谢

1 引言

2 实验材料

2.1 菌株和质粒

2.2 细胞株和病毒株

2.3 主要实验试剂

2.4 主要仪器设备

3 实验方法

3.1 重组中间载体的构建

3.1.1 重组中间载体pFB-D-PK2-EGFP的构建

3.1.2 重组中间载体pFB-D-Renilla-RFP的构建

3.2 重组杆粒Bacmid-PK2-EGFP和 Bacmid-Renilla-RFP的获得

3.3 重组病毒AcMNPV-PK2-EGFP和 AcMNPV-Renilla-RFP的获得

3.4 qPCR检测Sf9细胞中ac-pk2基因转录表达的变化

3.5 Western blot检测Sf9 细胞中磷酸化e IF2α的变化

3.6 外源蛋白海肾荧光素酶活性检测

3.7 总蛋白含量的检测

3.8 葡萄糖消耗速率的检测

3.9 上清中乳酸含量的检测

3.10 细胞内ATP含量检测

3.11 己糖激酶HK的活性检测

3.12 缺失型病毒的构建及子代病毒产量的检测

4 实验结果

4.1 获得重组病毒AcMNPV-PK2-EGFP

4.2 获得重组病毒AcMNPV-Renilla-RFP

4.3 重组病毒AcMNPV-PK2-EGFP可在宿主细胞内过表达Ac-PK2

4.4 过表达Ac-PK2 蛋白可抑制Sf9 细胞中e IF2α的磷酸化

4.5 重组病毒AcMNPV-PK2-EGFP侵染对蛋白质翻译的影响

4.6 重组病毒AcMNPV-PK2-EGFP侵染对Sf9 细胞能量代谢的影响

4.7 重组病毒AcMNPV-PK2-EGFP侵染宿主细胞可促进子代病毒增殖

5 讨论

第四章重组病毒AcMNPV-PK2-RFP通过影响线粒体途径促进宿主细胞的凋亡

1 引言

2 实验材料

2.1 菌株和质粒

2.2 细胞株和病毒株

2.3 主要实验试剂

2.4 主要仪器设备

3 实验方法

3.1 构建重组病毒AcMNPV-PK2-RFP

3.1.1 重组中间载体的构建

3.1.2 获得重组病毒AcMNPV-PK2-RFP

3.2 蚀斑实验检测病毒滴度

3.3 流式细胞术检测细胞凋亡

3.4 细胞内活性氧ROS水平检测

3.5 Western blot检测P53蛋白表达量的变化

3.6 胞质和线粒体分离

3.7 Western blot检测细胞色素c在胞质和线粒体的分布

3.8 线粒体膜电位（MMP）检测

4 实验结果

4.1 获得重组病毒AcMNPV-PK2-RFP

4.2 重组病毒AcMNPV-PK2-EGFP侵染可加速宿主细胞凋亡进程

4.3 重组病毒AcMNPV-PK2-RFP的侵染对Sf9细胞内ROS水平的影响

4.4 重组病毒AcMNPV-PK2-RFP侵染后Sf9细胞中线粒体膜电位（MMP）的分析

4.5 重组病毒AcMNPV-PK2-RFP的侵染对细胞色素c在胞质和线粒体的分布的影响

4.6 重组病毒AcMNPV-PK2-RFP的侵染对SfP53 蛋白表达的影响

5 讨论

第五章重组病毒AcMNPV-PK2-EGFP对甜菜夜蛾幼虫的抗虫活性和机制分析

1 引言

2 实验材料

2.1 病毒和幼虫

2.2 主要实验试剂

2.3 主要仪器设备

3 实验方法

3.1 甜菜夜蛾幼虫的饲养及感染

3.2 qPCR检测ac-pk2在被感染的甜菜夜蛾幼虫中肠组织、表皮组织和神经索组织的表达

3.3 qPCR检测重组病毒AcMNPV/AcMNPV-PK2-EGFP与AcMNPV-BmK IT共处理,BmKIT在甜菜夜蛾幼虫中肠组织、表皮组织和神经索组织的表达

3.4 qPCR检测解毒相关基因在被感染的甜菜夜蛾幼虫中肠组织的表达

3.5 酶标仪检测病毒侵染的甜菜夜蛾幼虫体内酚氧化酶的活性

3.6 Western blot分析病毒侵染的甜菜夜蛾幼虫中肠组织中凋亡相关蛋白P53的表达

3.7 Western blot分析病毒侵染的甜菜夜蛾幼虫中肠组织中eIF2a磷酸化的情况

3.8 统计对照组和病毒处理组甜菜夜蛾幼虫的平均体重,死亡率,蛹化率,羽化率

4 实验结果

4.1 ac-pk2 在病毒侵染的甜菜夜蛾幼虫中肠、表皮、神经索组织的转录表达情况

4.2 BmK IT在AcMNPV-PK2-EGFP和AcMNPV-Bm KIT共侵染的甜菜夜蛾幼虫中肠、表皮、神经索组织转录水平的表达情况

4.3 解毒相关基因p450、sod、cat在病毒侵染的甜菜夜蛾幼虫中肠组织的表达情况

4.4 重组病毒的侵染对甜菜夜蛾幼虫体内酚氧化酶活性的影响

4.5 重组病毒的侵染对甜菜夜蛾幼虫中肠组织P53蛋白表达的影响

4.6 重组病毒的侵染对甜菜夜蛾幼虫中肠组织eIF2α磷酸化的影响

4.7 重组病毒的侵染对甜菜夜蛾幼虫平均体重,致死率,蛹化率,羽化率的影响

5 讨论

总结与展望

参考文献

英文缩略语表

攻读学位期间取得的研究成果

致谢

个人简介及联系方式

文章来源

类型: 博士论文

作者: 卫丽丽

导师: 付月君

关键词: 细胞,细胞凋亡

来源: 山西大学

年度: 2019

分类: 基础科学

专业: 生物学,生物学

单位: 山西大学

分类号: Q78

总页数: 128

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AcMNPV侵染宿主细胞的进程中Ac-PK2和BmK IT的功能和机制研究

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