mTORC1和mTORC2在人肝细胞氨基酸代谢关键酶表达中的调控作用

论文摘要

肝脏是人体重要的物质代谢器官。肝细胞中的物质代谢是一个复杂的过程,受到各种内外因素的调控,其中信号转导通路发挥重要作用。肝脏天冬氨酸氨基转移酶（AST）、谷氨酸脱氢酶（GDH）、谷氨酸脱羧酶（GAD）、鸟氨酸脱羧酶（ODC）、谷胱甘肽硫转移酶（GST）和α-酮戊二酸脱氢酶（OGDH）等氨基酸代谢关键酶的含量反映肝脏的健康状态,但这些酶的表达调控机制并不十分清楚。mTORC1和mTORC2是细胞生长、代谢的中心协调器,目前对二者在肝细胞氨基酸代谢关键酶基因表达调控中的作用了解还很少。本研究首先以人正常肝细胞（HL-7702）和肝肿瘤细胞（HepG2）为模型,比较两种细胞中氨基酸代谢所涉及6种关键酶的表达差异;随之以HL-7702细胞为模型,研究mTORC1和mTORC2在氨基酸代谢关键酶基因表达调控中的作用与机制;最后通过比较分析,确定mTORC1和mTORC2在调控氨基酸代谢关键酶基因表达中的不同作用。实验利用RT-qPCR检测目的基因的mRNA水平,ELISA检测酶含量,Western blot检测mTORC1、mTORC2和转录因子NF-κB、STAT3活性变化。结果表明:（1）人正常肝细胞HL-7702细胞内AST、OGDH、GDH的含量显著高于肝癌细胞HepG2（p<0.01）,而GAD、ODC、GST显著低于HepG2（p<0.01）;HL-7702细胞培养液中AST、OGDH、GDH、GAD、ODC和GST含量低于HepG2细胞培养液中的含量;（2）Rapamycin处理HL-7702细胞,显著抑制mTORC1信号通路相关蛋白mTOR、S6和4EBP1的磷酸化水平,AST、OGDH、GDH、GAD、ODC和GST基因的mRNA水平显著减低（p<0.01）,细胞内和培养液中酶含量显著下降（p<0.01）;（3）HL-7702细胞转录后沉默Raptor基因,和对照组相比,mTOR、S6和4EBP1的磷酸化水平明显降低,AST、OGDH、GDH、GAD、ODC和GST基因mRNA水平显著降低（p<0.01）,细胞内酶含量显著减少（p<0.01）;（4）HL-7702细胞过表达Rheb基因,和对照组相比,mTOR、S6和4EBP1的磷酸化水平升高,AST、OGDH、GDH、GAD、ODC和GST基因mRNA水平显著升高（p<0.01）,细胞内酶含量明显升高（p<0.01）;（5）谷氨酸信号激活HL-7702细胞mTORC1信号通路,转录因子NF-κB活性增强,但对转录因子STAT3活性无影响;外源谷氨酸提高细胞AST基因mRNA水平（p<0.01）和酶含量（p<0.01）;（6）鸟氨酸信号激活HL-7702细胞mTORC1信号通路,增强转录因子NF-κB活性,对STAT3活性无影响,细胞ODC基因转录增强（p<0.05）,酶含量增加（p<0.05）;（7）HL-7702细胞转录后沉默Rictor基因,mTORC2信号通路相关蛋白mTOR和AKT的磷酸化水平下降,AST、OGDH、GDH、GAD、ODC和GST基因mRNA水平显著降低（p<0.01）,细胞内酶含量显著下降（p<0.01）;（8）HL-7702细胞过表达mTORC2关键组分mSIN1编码基因mSIN1,mTOR和AKT的磷酸化水平升高,AST、OGDH、GDH、GAD、ODC和GST基因mRNA水平显著升高（p<0.01）,细胞内酶含量明显升高（p<0.01）;（9）对比mTORC1和mTORC2对HL-7702细胞氨基酸代谢6种关键酶基因表达的影响,mTORC1的调控作用强于mTORC2。综上所述,AST、OGDH、GDH、GAD、ODC和GST等氨基酸代谢关键酶含量在人正常肝细胞HL-7702与肝肿瘤细胞HepG2中的合成与分泌存在差别,HepG2分泌6种酶的能力强于HL-7702,为以后利用这些酶含量变化预测肝细胞恶性转化提供了基础数据。HL-7702细胞中,mTORC1调节氨基酸代谢相关关键酶基因AST、OGDH、GDH、GAD、ODC和GST表达和酶分泌;mTORC1介导谷氨酸或鸟氨酸信号,通过调节转录因子NF-κB活性调节AST或ODC表达。mTORC2也参与上述6个基因的表达,其调控作用相对弱于mTORC1。研究结果展示了肝细胞中氨基酸代谢关键酶基因的表达调控模型,对进一步了解肝脏中氨基酸的代谢机制,为临床靶向治疗肝脏疾病提供一定的科学依据。

论文目录

• 摘要
• abstract
• 英文缩略词表
• 第一章 mTOR信号通路调控氨基酸代谢关键酶表达的研究进展
•   1 雷帕霉素的发现及功能
•   2 mTOR及其复合物
•     2.1 mTOR基因及蛋白的分子特性
•     2.2 两种mTOR复合物
•       2.2.1 mTORC1的组成及功能
•       2.2.2 mTORC2的组成及功能
•   3 mTOR信号通路及功能
•     3.1 mTORC1通路的组成及功能
•     3.2 mTORC2通路的组成及功能
•   4 mTOR信号通路与氨基酸代谢
•     4.1 氨基酸代谢关键酶
•     4.2 mTOR信号通路与氨基酸分解代谢
• 第二章 mTORC1和mTORC2在人肝细胞氨基酸代谢关键酶基因表达中的调控作用与比较分析
•   1 引言
•     1.1 氨基酸在肝脏中的代谢
•     1.2 mTOR信号通路与氨基酸分解代谢
•     1.3 研究目的和意义
•   2 实验材料与方法
•     2.1 实验材料
•       2.1.1细胞系
•       2.1.2 菌株和质粒
•       2.1.3 主要实验试剂和耗材
•     2.1.3.1 细胞培养和处理相关主要试剂
•     2.1.3.2 过表达载体构建相关主要试剂
•     2.1.3.3 实时定量PCR相关主要试剂
•     2.1.3.4 Western blot相关主要试剂
•     2.1.3.5 ELISA相关主要试剂
•       2.1.4 主要耗材和仪器
•     2.2 实验方法
•       2.2.1细胞培养
•     2.2.1.1 培养基的配制
•     2.2.1.2 细胞的复苏
•     2.2.1.3 细胞的换液
•     2.2.1.4 细胞的计数与传代
•     2.2.2.5 细胞的冻存
•       2.2.2 人正常肝细胞HL-7702和肝肿瘤细胞HepG2氨基酸代谢关键酶含量的测定
•     2.2.2.1 HL-7702和HepG2胞内氨基酸代谢关键酶含量的测定
•     2.2.2.2 HL-7702和HepG2细胞培养液中氨基酸代谢关键酶的测定
•       2.2.3 mTORC1对HL-7702细胞氨基酸代谢关键酶表达与分泌的影响
•     2.2.3.1 Rapamycin对HL-7702细胞氨基酸代谢关键酶合成与分泌的影响
•     2.2.3.2 转录后沉默Raptor对HL-7702细胞氨基酸代谢关键酶表达的影响
•     2.2.3.3 过表达Rheb对HL-7702细胞氨基酸代谢关键酶表达的影响
•     2.2.3.4 mTORC1介导氨基酸信号激活NF-κB对HL-7702细胞AST和ODC表达的影响
•       2.2.4 mTORC2对HL-7702细胞氨基酸代谢关键酶表达的影响
•     2.2.4.1 转录后沉默Rictor对HL-7702细胞氨基酸代谢关键酶表达的影响
•     2.2.4.2 过表达mSIN1对HL-7702细胞氨基酸代谢关键酶表达的影响
•       2.2.5 mTORC1和mTORC2对HL-7702细胞氨基酸代谢关键酶表达的影响比较
•     2.2.5.1 标化Raptor和Rictor的沉默效率
•     2.2.5.2 比较Raptor和Rictor沉默对HL-7702细胞氨基酸代谢关键酶基因转录的影响
•     2.2.5.3 比较Raptor和Rictor沉默对HL-7702细胞氨基酸代谢关键酶蛋白表达的影响
•   3 结果
•     3.1 人正常肝细胞HL-7702和肝肿瘤细胞HepG2氨基酸代谢关键酶含量的比较
•       3.1.1 HL-7702和HepG2细胞内氨基酸代谢关键酶含量具有显著差异
•       3.1.2 HL-7702和HepG2细胞培养液中氨基酸代谢关键酶的含量有差异
•     3.2 mTORC1对HL-7702细胞氨基酸代谢关键酶基因表达调控的作用与机制
•       3.2.1 Rapamycin抑制HL-7702细胞氨基酸代谢关键酶的合成与分泌
•     3.2.1.1 Rapamycin抑制HL-7702细胞内氨基酸代谢关键酶的合成
•     3.2.1.2 Rapamycin抑制HL-7702细胞氨基酸代谢关键酶的分泌
•     3.2.1.3 Rapamycin抑制HL-7702细胞mTORC1信号通路活性
•       3.2.2 转录后沉默Raptor减弱HL-7702细胞氨基酸代谢关键酶基因的表达
•     3.2.2.1 pRNAT-Raptor-shRNA载体构建并转染HL-7702细胞
•     3.2.2.2 转录后沉默Raptor减弱HL-7702细胞氨基酸代谢关键酶合成
•     3.2.2.3 转录后沉默Raptor减弱HL-7702细胞mTORC1通路活性
•       3.2.3 过表达Rheb促进HL-7702细胞氨基酸代谢关键酶基因的表达
•     3.2.3.1 pIRES2-EGFP-Rheb载体构建并转染HL-7702细胞
•     3.2.3.2 过表达Rheb促进HL-7702细胞内氨基酸代谢关键酶合成
•     3.2.3.3 过表达Rheb增强HL-7702细胞mTORC1通路活性
•       3.2.4 mTORC1介导氨基酸信号激活NF-κB促进HL-7702细胞AST和 ODC表达
•     3.3.4.1 谷氨酸促进HL-7702细胞AST表达
•     3.3.4.2 谷氨酸激活HL-7702细胞mTORC1通路和转录因子NF-κB活性
•     3.3.4.3 鸟氨酸促进HL-7702细胞ODC表达
•     3.3.4.4 鸟氨酸激活HL-7702细胞mTORC1通路和转录因子NF-κB活性
•     3.3 mTORC2对HL-7702细胞氨基酸代谢关键酶基因表达调控的作用
•       3.3.1 转录后沉默Rictor减弱HL-7702细胞氨基酸代谢关键酶基因的表达
•     3.3.1.1 pRNAT-Rictor-shRNA载体构建并转染HL-7702细胞
•     3.3.1.2 转录后沉默Rictor减弱HL-7702细胞氨基酸代谢关键酶合成
•     3.3.1.3 转录后沉默Rictor减弱HL-7702细胞mTORC2通路活性
•       3.3.2 过表达mSIN1促进HL-7702细胞氨基酸代谢关键酶基因的表达
•     3.3.2.1 pIRES2-EGFP-mSIN1载体构建并转染HL-7702细胞
•     3.3.2.2 过表达mSIN1促进HL-7702细胞内氨基酸代谢关键酶合成
•     3.3.2.3 过表达mSIN1增强HL-7702细胞mTORC2通路活性
•     3.4 mTORC1和mTORC2影响HL-7702细胞氨基酸代谢关键酶表达的效力比较
•       3.4.1 Raptor和Rictor沉默效率的标化
•       3.4.2 Raptor和Rictor沉默影响HL-7702细胞氨基酸代谢关键酶基因转录的效力比较
•       3.4.3 Raptor和Rictor沉默影响HL-7702细胞氨基酸代谢关键酶蛋白表达的效力比较
•   4 讨论
•   5 结论
• 参考文献
• 附录
• 致谢
• 硕士期间发表论文情况

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 张猛

导师: 王志钢

关键词: 氨基酸代谢

来源: 内蒙古大学

年度: 2019

分类: 基础科学,医药卫生科技

专业: 生物学,基础医学

单位: 内蒙古大学

分类号: R329.2

总页数: 104

文件大小: 5588K

下载量: 289