还原氨氧化衍生方法及其在寡糖分析中的应用

论文摘要

糖类物质是生命体内重要的信息分子,广泛参与到免疫、癌变、衰老等许多生命活动中,因此对于糖的检测分析具有重要的意义。目前糖类物质的分析手段主要是利用色谱、质谱等仪器进行分析,但由于糖本身结构复杂、亲水性强、极性大等固有特征,在进行分析前通常对其进行衍生化处理以改善其分离效果、增强光学或质谱检测信号。本文采用一种新型氨氧基荧光衍生化试剂4-氨氧基甲基-7-羟基-香豆素（AOHC）结合还原氨氧化衍生方法,成功地对糖进行了荧光标记与色谱质谱分析,实现了高选择性与高灵敏度检测。主要研究结果如下:1、我们利用AOHC对寡糖进行肟化标记,并将之用于N-聚糖分析。通过依次使用单因子优化方法和响应曲面法,以衍生产物色谱峰峰面积为观察值,详细考察并优化了AOHC肟化衍生条件。与传统的2-AB衍生化法相比,本方法具有快速、灵敏、操作简便等优势。采用该方法,我们成功分析了糖蛋白RNase B中所有的N-聚糖。2、在前期研究的基础上,优化了衍生反应条件,即通过将样品溶液离心浓缩的方式来加快衍生反应的进行。随着溶剂的不断挥发,反应物浓度不断增大,进而促进了衍生反应的进行。该方法操作简便,无需添加缓冲液、催化剂,反应条件温和,在35℃条件下反应30 min即可。随后利用氰基硼氢化钠对肟化产物进行还原,实现了对寡糖的HPLC分离分析。将该方法应用到咖啡中寡糖的检测分析,成功测定了各寡糖的含量,样品回收率在88.1105.3%之间,日内RSD小于2.87%、日间RSD小于7.70%。AOHC衍生化方法在寡糖的定量定性分析中有着很好的应用前景。3、探究了7种有机催化剂在AOHC衍生DP7的反应中的应用,各催化剂的催化效果依次为:对苯二胺、2-胺基-5-甲氧基苯甲酸、2-胺基-5-甲基苯甲酸、3,5-二胺基苯甲酸、苯胺、四氢吡咯、三乙胺。其中,2-胺基-5-甲氧基苯甲酸、对苯二胺催化效果最好,并且在中性条件下,仍具有很好的催化效果。我们将这两种催化剂用于婴儿奶粉中寡糖的检测,成功测得其中9种寡糖。实验结果表明,对苯二胺和2-氨基-5-甲氧基苯甲酸在催化肟化反应中有着很好的应用前景。

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 第1章 绪论
•   1.1 概述
•   1.2 寡糖的生物活性
•     1.2.1 抗氧化
•     1.2.2 抗肿瘤
•     1.2.3 抗病毒感染
•     1.2.4 降血糖、降血脂
•     1.2.5 调节肠道菌群
•   1.3 寡糖的检测方法
•     1.3.1 气相色谱（GC）
•     1.3.2 高效液相色谱（HPLC）
•       1.3.2.1 高效阴离子交换色谱（HPAEC）
•       1.3.2.2 反相液相色谱（RPC）
•       1.3.2.3 亲水作用色谱（HILIC）
•       1.3.2.4 石墨化碳色谱（GCC）
•     1.3.3 毛细管电泳（CE）
•       1.3.3.1 毛细管区带电泳（CZE）
•       1.3.3.2 胶束电动色谱（MEKC）
•       1.3.3.3 毛细管凝胶电泳（CGE）
•       1.3.3.4 毛细管电色谱（CEC）
•       1.3.3.5 毛细管亲和电泳（CAE）
•       1.3.3.6 微芯片电泳技术
•     1.3.4 质谱（MS）
•       1.3.4.1 离子源
•       1.3.4.2 质量分析器
•   1.4 寡糖的衍生化方法
•     1.4.1 还原胺化
•     1.4.2 迈克尔加成
•     1.4.3 肼衍生
•     1.4.4 泛甲基化
•     1.4.5 肟化反应
•     1.4.6 小结
•   1.5 有机催化剂在肟化反应中的应用
•   1.6 本论文研究目的及意义
• 第2章 基于肟化反应的寡糖衍生新方法的建立
•   2.1 引言
•   2.2 实验部分
•     2.2.1 实验仪器与试剂
•     2.2.2 AOHC荧光性质分析
•     2.2.3 AOHC衍生寡糖反应
•     2.2.4 HPLC-FLD分析
•     2.2.5 MALDI-MS分析
•     2.2.6 核糖核酸酶B（RNase B）样品处理
•   2.3 结果与讨论
•     2.3.1 AOHC荧光性质分析
•     2.3.2 AOHC衍生寡糖反应探索
•     2.3.3 衍生反应条件优化
•       2.3.3.1 衍生反应条件的单因子优化
•       2.3.3.2 响应曲面优化
•     2.3.4 与常用衍生方法的比较
•     2.3.5 RNase B中寡糖分析
•   2.4 本章小结
• 第3章 还原氨氧化衍生方法的建立及应用
•   3.1 引言
•   3.2 实验部分
•     3.2.1 实验试剂与仪器
•     3.2.2 真空离心浓缩仪中AOHC与寡糖衍生反应
•     3.2.3 咖啡样品前处理
•     3.2.4 HPLC-FLD及质谱分析
•   3.3 结果讨论
•     3.3.1 离心浓缩仪中衍生反应探索
•     3.3.2 衍生反应条件优化
•     3.3.3 恒温水浴中反应与离心浓缩仪中反应衍生效果对比
•     3.3.4 肟化产物还原
•     3.3.5 AOHC衍生混合寡糖
•     3.3.6 分析方法验证
•     3.3.7 与其他衍生方法比较
•     3.3.8 实际样品分析
•   3.4 本章小结
• 第4章 有机催化剂在寡糖肟化衍生中的应用
•   4.1 前言
•   4.2 实验部分
•     4.2.1 实验仪器与试剂
•     4.2.2 AOHC衍生DP7 样品制备
•     4.2.3 奶粉样品处理
•     4.2.4 色谱分析
•     4.2.5 NanoLC-MS分析
•   4.3 结果与讨论
•     4.3.1 反应时间对各催化剂催化效果的影响
•     4.3.2 反应pH对各催化剂催化效果的影响
•     4.3.3 反应温度对各催化剂催化效果的影响
•     4.3.4 奶粉中寡糖的检测
•   4.4 本章小结
• 第5章 结论
• 致谢
• 参考文献
• 附录 A 奶粉中寡糖检测质谱图
• 攻读学位期间获得与硕士学位论文相关的科研成果

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 朱文杰

导师: 林亚维

关键词: 寡糖,肟化反应,还原氨氧化,氨氧基甲基羟基香豆素,高效液相色谱荧光检测法

来源: 武汉理工大学

年度: 2019

分类: 基础科学,工程科技Ⅰ辑

专业: 生物学,化学

单位: 武汉理工大学

分类号: Q503;O657.3

DOI: 10.27381/d.cnki.gwlgu.2019.000501

总页数: 82

文件大小: 2354K

下载量: 15