拟南芥WD40家族蛋白TAWD在抵御高温胁迫中的功能研究

论文摘要

前期本实验室建立了基于拟南芥热诱导基因HSP18.2启动子驱动的萤火虫萤光素酶（HSP18.2:LUC）活性变化的突变体筛选方法,筛选得到高温下萤光增强的突变体tawd（Thermotolerance Associated WD40 repeat protein）。该突变体在高温处理后与野生型相比表现出高萤光素酶活性和对高温敏感。用图位克隆的方法克隆到了突变基因TAWD。该基因编码一个含WD40重复序列结构域（WD40 repeat protein,WDR）的蛋白,在本文中命名为TAWD,它在拟南芥各组织中组成型表达。WD40蛋白家族成员作为生物大分子相互作用的支架蛋白,在真核生物中广泛存在,在拟南芥中参与植物的生长和发育过程,被认为是发育和胁迫信号传递过程中的关键调控因子。本文通过耐热实验发现tawd的基础耐热性和获得性耐热能力与野生型相比减弱了。亚细胞定位发现TAWD主要分布在细胞核中,在细胞中的分布不受高温的影响。虽然正常培养条件下TAWD在野生型中表达量较低并受高温抑制,但通过免疫印迹（Western Blot）定量实验发现高温条件下TAWD的翻译水平与正常培养温度下的相比逐渐上调。热胁迫条件下,大多数热激响应（HSR）基因,如热激转录因子（HSFs）、热激蛋白（HSPs）等在tawd中的转录水平和野生型中的相比下调了。通过染色质免疫共沉淀（ChIP）技术检测到TAWD与HSP89.1的启动子区结合。这些结果说明TAWD是植物耐热所必需的,在参与HSR基因表达调控过程中主要起正调控作用。通过RNA免疫共沉淀（RIP）技术检测到TAWD与HSP18.和HSP101的mRNA有结合,如前述,高温胁迫下HSP18.2,HSP101的转录水平在tawd中与在野生型相比下调了,推测TAWD可能参与维持mRNA稳定性。另外,受到热胁迫后,tawd中HSFA7a,HSFAb和HSFB1等HSFs基因mRNA的内含子保留增加了,这说明TAWD可能参与调控mRNA的可变剪接。最后,我们通过免疫沉淀和质谱联用的技术鉴定到TAWD与HSP70-1、HSP90.2等蛋白相互作用,前人研究显示拟南芥HSP70-1与辅助分子伴侣BAG4有相互作用。因此,我们进一步利用双分子萤光素酶的互补（Bimolecular Luciferase complementation,BiLC）实验和免疫共沉淀（Co-IP）技术分析了它们的互作,但没有检测到TAWD与HSP70-1、BAG4、HSP90.2等的直接相互作用。我们还创建了tawd、hsp70-1、bag4的多突变体材料,分析它们的LUC活性变化发现tawd/hsp70-1、tawdbag4、tawd/hsp70-1/bag4双突变体和三突变体的LUC活性表现出和tawd类似的变化,在高温胁迫下升高;耐热分析的结果显示,tawdhsp70-1和tawd/bag4与tawd相比在高温胁迫后的存活率上升了,而tawd/hsp70-1/bag4三突变体的耐热性比野生型更强。这些结果说明TAWD、HSP70-1和BAG4共同参与调控植物的耐热性。综上所述,TAWD可能作为一个热激响应的信号整合因子,在参与植物耐热性的调控过程中起着非常重要的作用。首先,TAWD参与调控HSR基因的表达,通过直接与HSP89.1启动子区域的顺式元件结合调控它的转录;其次TAWD可能参与维持HSR基因的mRNA稳定性和调控RNA的可变剪接,高温胁迫下,在tawd中检测到HSP18.2和HSPl01表达下调和RIP检测到TAWD与HSP18.2和HSP101的mRNA结合,同时热胁迫下HSFA2、HSFA7a等HSFs在tawd中出现内含子保留增加的剪接变化;最后,TAWD、HSP70-1和BAG4共同参与调控植物的耐热性,同时敲除TAWD、HSP70-1和BAG4可显著提高植物的耐热性。TAWD可能通过调控HSR基因的表达,与HSP70-1和BAG4—起参与调节植物的耐热性,提高植物在高温环境下的适应能力。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 前言
•   1.1 植物的高温胁迫生理和耐受机制
•   1.2 热激转录因子及其功能
•   1.3 热激蛋白家族蛋白及其功能
•   1.4 选择性剪接
•   1.5 WD40家族蛋白简介
•   1.6 研究背景与立题依据
• 第二章 实验材料与方法
•   2.1 实验材料
•     2.1.1 植物材料
•     2.1.2 菌株和质粒载体
•     2.1.3 常用的试剂和培养基
•   2.2 实验方法
•     2.2.1 拟南芥无菌苗的获得和培养
•     2.2.2 拟南芥的耐热性实验
•     2.2.3 拟南芥幼苗的LUC化学发光成像
•     2.2.4 拟南芥总RNA的提取
•     2.2.5 拟南芥DNA的提取
•     2.2.6 RT-PCR
•     2.2.7 细菌的转化
•     2.2.8 亚细胞定位
•     2.2.9 实时荧光定量
•     2.2.10 免疫印迹（Western Blot）
•     2.2.11 双分子萤光素酶互补实验
•     2.2.12 免疫沉淀（Immunoprecipitation,IP）与免疫共沉淀（Co-IP）
•     2.2.13 染色质免疫共沉淀（ChIP）与RNA的免疫共沉淀（RIP）
• 第三章 实验结果与分析
•   3.1 拟南芥热耐受需要TAWD的参与
•     3.1.1 TAWD的突变导致耐热性的丧失
•     3.1.2 温度不影响TAWD的分布
•   3.2 TAWD参与调控基因表达
•     3.2.1 TAWD突变导致LUC活性增加
•     3.2.2 TAWD参与热激响应基因的调控
•     3.2.3 全基因组水平上的RNA-seq分析
•     3.2.4 TAWD直接调控HSP89.1的表达
•     3.2.5 TAWD影响可变剪接
•     3.2.6 TAWD与HSR基因的mRNA有结合
•   3.3 TAWD潜在的互作蛋白
•     3.3.1 IP-MS鉴定到互作的HSP
•     3.3.2 IP互作蛋白的验证
•     3.3.3 表型验证
• 第四章 讨论
•   4.1 TAWD调控基因表达
•     4.1.1 TAWD突变导致LUC活性增加
•     4.1.2 HSP18.2:LUC报基因系统不影响内源HSP18.2的表达
•     4.1.3 TAWD参与热激响应基因的调控
•     4.1.4 TAWD参与调控mRNA的剪接与稳定性
•   4.2 TAWD与HSP70-1和BAG4调控植物的耐热性
• 附录
• 参考文献
• 致谢

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 夏凯文

导师: 杨万年,金烨

关键词: 拟南芥,高温胁迫,家族蛋白,热激转录因子,热激蛋白

来源: 华中师范大学

年度: 2019

分类: 基础科学

专业: 生物学,生物学

单位: 华中师范大学

基金: 国家自然科学基金项目(批准号31470365)

分类号: Q943.2

总页数: 64

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