I-B-Svi型CRISPR-Cas系统在谷氨酸棒状杆菌中的基因编辑

论文摘要

谷氨酸棒状杆菌（Corynebacterium glutamicum）是一种不具有CRISPR-Cas系统的生产氨基酸的重要工业微生物,在发酵过程中会产生许多有用的代谢产物,如:谷氨酸、丁二烯等,在工业生产中有非常重要的地位。随着基因工程和基因编辑技术的快速发展,很多研究人员试图在基因水平上人工掌控微生物的生长和代谢,以使利益最大化。但因谷氨酸棒状杆菌与Cas9存在生物相容性问题（表达Cas9的菌株无法生长）,目前CRISPR/Cas9系统无法直接应用于谷氨酸棒状杆菌的基因编辑中。基因组编辑技术（简称基因编辑技术）与常说的基因工程一样都是改变细胞的遗传特性,但不同点主要在于基因编辑技术直接针对细胞的染色体,从而使其功能远大于依靠载体的传统基因工程。CRISPR-Cas是原核中的适应性免疫系统,是最前沿的基因编辑技术,可对原核和真核细胞基因组中的基因进行缺失、插入、和替换,且具有简单、快速和有效的显著的优势。文献报道的能够进行基因编辑的方法主要包括2类II型（CRISPR/Cas9）和V型（Cpfl/Cas12a）,尤以化脓链球菌中的II型CRISPR/Cas9系统应用最为广泛。但该系统也具有其局限性,如:脱靶和生物相容性等。I型CRISPR-Cas系统是自然界中最常见的类型,该系统中的Cas3在降解DNA时通常是逐步降解而不是直接产生双链断裂,这也可能是为什么I型CRISPR-Cas系统是自然界中最常见的原因。然而,迄今为止,除本实验室外,源自I型CRISPR-Cas系统的基因编辑工具未见报道。本实验室从化工制药厂的活性污泥中分离得到一株能够以甾体化合物为唯一碳源进行生长的放线菌,我们将其命名为:维吉尼亚链霉菌IBL14（Streptomyces virginiae IBL14）,该菌株的全基因组测序分析发现:基因组上存在一个I-B-Svi型CRISPR-Cas系统。幸运的是:本实验室前期基于该系统的Cascade和单一的SviCas3已在该菌株自身、大肠杆菌和酿酒酵母中实现了基因编辑。本论文旨在研究SviCas3与谷氨酸棒状杆菌间的生物相容性,进而开发基于该菌株的基因编辑工具。实验中,我们构建了 2个蛋白表达质粒（pEC-XK99E-cas753;pEC-XK99E-cas3中起始密码子为ATG）和3个基因编辑质粒（pXMJ19-t/g-△ldh;pXMJ1 9-t/g-△ldh::egfp;pXMJ19-t/g-△ldh::cat）,并通过两步电转化将蛋白表达质粒和基因编辑质粒分别电转至谷氨酸棒状杆菌电转感受中。验证结果表明:（1）含有直接来源于维吉尼亚链霉菌IBL14染色体中基因cas7、cas5和cas3的蛋白表达质粒pEC-XK99E-cas753结合基因编辑质粒可成功的对谷氨酸棒状杆菌进行基因组编辑（乳酸脱氢酶基因内部敲除了615 bp）。（2）仅含直接来源于维吉尼亚链霉菌IBL14染色体中单一cas3基因的蛋白表达质粒pEC-XK99E-cas3结合基因编辑质粒也能成功的对谷氨酸棒状杆菌进行基因组编辑（成功的将egfp、cat基因插入到乳酸脱氢酶内部）。（3）脱靶分析研究中未发现脱靶事件。（4）基于Cas9构建的、作为对照试验的基因编辑中没有得到谷氨酸棒状杆菌的转化子。总之:本论文（1）首次证实直接源于I-B-Svi型CRISPR-Cas系统中Svicas7-5-3基因的所开发的编辑工具能对该菌株进行基因组编辑,表明原核微生物中基因的碱基偏好要求不严;（2）首次证实了单一的未优化的SviCas3可对谷氨酸棒状杆菌的基因组进行编辑,表明在谷氨酸棒状杆菌中SviCas3比SpCas9生物相容性好;（3）潜在打靶位点的测序分析中未发现有脱靶现象,支持别人已发表的Cas3不参与靶序列定位的研究观点,暗藏着重要的应用前景。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 缩略词表
• 第一章 概述
•   1.1 谷氨酸棒状杆菌与基因工程
•   1.2 CRISPR-Cas系统
•   1.3 1类I型CRISPR-Cas系统的干扰机制
•   1.4 研究意义,研究内容和方案
• 第二章 cas753构建的蛋白表达质粒与基因编辑质粒对谷氨酸棒状杆菌的基因编辑
•   2.1 前言
•   2.2 材料和方法
•     2.2.1 菌株与质粒
•     2.2.2 主要仪器,试剂及试剂配制
•     2.2.3 实验方法
•   2.3 结果与讨论
•     2.3.1 谷氨酸棒状杆菌基因组的提取
•     2.3.2 pXMJ19质粒制备
•     2.3.3 ldh基因上下游同源臂的制备
•     2.3.4 ldh基因的g-DNA制备
•     2.3.5 基因编辑质粒pXMJ19-t-△ldh的验证
•     2.3.6 基因编辑质粒pXMJ19-t/g-△ldh的验证
•     2.3.7 蛋白表达质粒pEC-XK99E-cas753的构建和验证结果
•     2.3.8 蛋白表达质粒pEC-XK99E-cas753转入谷氨酸棒状杆菌后的验证
•     2.3.9 蛋白表达质粒pEC-XK99E-cas753与基因编辑质粒pXMJ19-t/g-△ldh对谷氨酸棒状杆菌ldh基因的敲除与验证
•   2.4 结论
• 第三章 单基因Cas3构建的蛋白表达质粒与基因编辑质粒对谷氨酸棒状杆菌的基因编辑
•   3.1 前言
•   3.2 材料和方法
•     3.2.1 菌株与质粒
•     3.2.2 主要仪器,试剂及试剂配制
•     3.2.3 实验方法
•   3.3 结果和讨论
•     3.3.1 ldh基因上下游同源臂及插入片段的制备
•     3.3.2 ldh基因的gDNA制备
•     3.3.3 pXMJ19- t-△ldh::egfp与pXMJ19- t-△ldh::cat质粒的验证
•     3.3.4 基因编辑质粒pXMJ19-t/g-△ldh::egfp与pXMJ19-t/g-△ldh::cat的验证
•     3.3.5 蛋白表达质粒pEC-XK99E-cas3的构建和验证结果
•     3.3.6 蛋白表达质粒pEC-XK99E-cas3转入谷氨酸棒状杆菌后的验证
•     3.3.7 蛋白表达质粒pEC-XK99E-cas3与基因编辑质粒pXMJ19-t/g-△ldh::egfp、pXMJ19-t/g-△ldh::cat分别对谷氨酸棒状杆菌ldh基因的敲除与验证
•   3.4 结论
• 第四章 脱靶分析
•   4.1 前言
•   4.2 材料和方法
•     4.2.1 菌株与质粒
•     4.2.2 主要仪器,试剂及试剂配制
•     4.2.3 实验方法
•   4.3 结果与讨论
•   4.4 结论
• 第五章 结论与展望
•   5.1 结论
•   5.2 展望
• 附图
• 参考文献
• 致谢
• 文章与专利

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 夏婷婷

导师: 童望宇

关键词: 谷氨酸棒状杆菌,系统,基因编辑,乳酸脱氢酶,脱靶分析

来源: 安徽大学

年度: 2019

分类: 基础科学

专业: 生物学

单位: 安徽大学

分类号: Q78

总页数: 82

文件大小: 5193K

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