Activin A和BMP4对小鼠胚胎干细胞发育潜能的影响

论文摘要

自从上世纪八十年代初,研究人员利用含有饲养层细胞和血清的培养体系,由小鼠受精后3.5天囊胚（E3.5）的内细胞团获得胚胎干细胞（mouse embryonic stem cells,mESCs）后,在接下来的近四十年中,已经有多种能够维持自我更新并且表达不同表观遗传特征与转录组图谱的mESCs被陆续发现。本文利用本实验室化学成分明确的ABC/L培养体系（Activin A、BMP4、CHIR99021和mLif）对2i/Lif（2i:PD0325901和CHIR99021,Lif:mLif）培养体系来源的mESCs进行诱导,即用Activin A和BMP4替代PD0325901,得到了ABC/L-ESCs,对其进行进一步的分析与鉴定,探讨其多能性、转录组特征及发育潜能等。具体实验结果如下:1.克隆形态与碱性磷酸酶染色结果显示,ABC/L-ESCs与2i/L-ESCs在形态上并无明显差异,都呈三维穹顶式圆锥形克隆,且碱性磷酸酶染色结果也无差异,都呈阳性。2.核型分析结果显示,ABC/L-ESCs染色体数目正常的比例显著高于2i/L-ESCs。3.免疫荧光染色结果显示:ABC/L-ESCs与2i/L-ESCs都表达Oct4、Sox2及Nanog等多能干细胞特异性蛋白,且并无明显差异。4.RNA-seq分析结果显示:ABC/L-ESCs与2i/L-ESCs相比有989个差异表达基因,其中有362个基因表达上调,这些基因与培养在血清（serum）与Lif中的ESCs,即S/L-ESCs相似,上调基因主要与MAPK信号串联、发育、SMAD蛋白信号转导、DNA结合位点的调控以及与配子发生相关的DNA甲基化有关;同时,结果也表明ABC/L-ESCs的生物学特性接近于体内胚胎E4.5-E5.5之间。5.甲基化结果显示,ABC/L-ESCs甲基化水平显著高于2i/L-ESCs,接近于S/L-ESCs。同时对甲基转移酶基因Dnmt3a,Dnmt3b以及相关辅因子Dnmt3l的mRNA表达量进行检测,以探讨ABC/L-ESCs的高甲基化水平的机理,结果显示这三个基因在ABC/L-ESCs中的表达量显著高于2i/L-ESCs;此外,与DNA甲基化调控相关基因Prdm14和Nanog在ABC/L-ESCs中的表达显著低于2i/L-ESCs。6.嵌合体实验结果显示,单个ABC/L-ESCs或2i/L-ESCs注入到小鼠8细胞胚胎中时,其嵌合能力明显高于S/L-ESCs。收集E10.5嵌合胚胎后发现,对照组2i/L-ESCs只能贡献到胎儿部分,并不能贡献到胚外组织;而单个S/L-ESCs细胞不能贡献嵌合体发育,只有注入15-20个细胞时,其嵌合发育能力与2i/L-ESCs相似;相比之下,实验组ABC/L-ESCs的嵌合发育能力显著高于两个对照组,即单个细胞即能贡献到胎儿组织,也能贡献到部分胎盘及卵黄囊,并且随着在ABC/L培养体系中培养时间的延长,嵌合体贡献能力也在逐渐增强。收集E12.5的生殖嵴发现,ABC/L-ESCs所携带的GOF/GFP+细胞可贡献到生殖嵴部分。7.四倍体补偿实验结果显示:ABC/L-ESCs通过四倍体补偿技术可以得到健康成活的小鼠。综上所述,本实验得到了一种可以在化学成分高度明确的培养体系中长期稳定传代的新型胚胎干细胞系ABC/L-ESCs。ABC/L-ESCs不仅有着与2i/L-ESCs相似的形态与自我更新能力,同时有着独特的转录组特征以及较高的DNA甲基化水平,并维持着稳定的基因组特征。在发育潜能上,ABC/L-ESCs有着更高的发育潜能,可以贡献到胎儿,PGCs以及部分胚外组织。关于ABC/L培养体系对ESCs的分子调控机制,我们将在接下来的研究中做进一步探究。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 缩略词表
• 第一章 文献综述
•   1.1 小鼠胚胎干细胞的研究进展
•     1.1.1 小鼠胚胎干细胞的简介
•     1.1.2 小鼠胚胎干细胞多能性的研究
•     1.1.3 DNA甲基化与小鼠胚胎干细胞相关研究
•   1.2 Activin及 BMPs相关信号通路的研究
•     1.2.1 Activin及相关信号通路研究
•     1.2.2 BMPs及相关信号通路研究
• 第二章 ABC/L-ESCs的诱导及生物学特性检测
•   2.1 实验材料
•     2.1.1 实验设备与器材
•     2.1.2 实验试剂及抗体
•   2.2 实验方法
•     2.2.1 主要试剂的配制
•     2.2.2 小鼠ABC/L-ESCs细胞系的诱导及其培养
•     2.2.3 小鼠ABC/L-ESCs细胞系的冻存与复苏
•     2.2.4 碱性磷酸酶染色
•     2.2.5 核型分析
•     2.2.6 免疫荧光染色
•   2.3 实验结果
•     2.3.1 形态学鉴定与碱性磷酸酶（AP）染色鉴定
•     2.3.2 核型分析鉴定
•     2.3.3 免疫荧光染色鉴定
•   2.4 讨论
• 第三章 ABC/L-ESCs的分子生物学特性分析
•   3.1 实验材料
•     3.1.1 实验设备与器材
•     3.1.2 实验试剂
•   3.2 实验方法
•     3.2.1 培养液的配制
•     3.2.2 RNA-seq文库的准备及分析
•     3.2.3 BS-seq文库的准备及DNA甲基化水平分析
•     3.2.4 ABC/L-ESCs的实时荧光定量PCR检测
•   3.3 实验结果
•     3.3.1 RNA-seq分析结果
•     3.3.2 甲基化分析结果
•   3.4 讨论
• 第四章 ABC/L-ESCs体内发育潜能分析
•   4.1 实验材料
•     4.1.1 实验设备和器材
•     4.1.2 实验试剂
•     4.1.3 实验动物
•   4.2 实验方法
•     4.2.1 主要试剂的配制
•     4.2.2 细胞的转染
•     4.2.3 胚胎的获得
•     4.2.4 嵌合体的制备
•     4.2.5 四倍体补偿技术制备ABC/L-ESCs小鼠
•   4.3 实验结果
•     4.3.1 单个小鼠ABC/L-ESCs的嵌合能力鉴定
•     4.3.2 小鼠ABC/L-ESCs在 E10.5 胚胎中的嵌合能力检测
•     4.3.3 生殖嵴转移能力检测
•     4.3.4 四倍体补偿能力鉴定
•   4.4 讨论
• 结论
• 参考文献
• 致谢

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 杨志青

导师: 包斯琴

关键词: 小鼠胚胎干细胞,甲基化,发育潜能

来源: 内蒙古大学

年度: 2019

分类: 基础科学

专业: 生物学

单位: 内蒙古大学

分类号: Q344

总页数: 64

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