全文摘要
本发明公开了一种丹酚酸B的提取分离方法：(1)选取丹参药材：选取合乎药典规定的丹参药材饮片；(2)提取：按照重量份，称取丹参药材饮片1份，加入pH5.0的水12份，加入每克药材5‑15U的木聚糖酶，莱鲍迪甙和\/或甜菊糖甙，38‑45℃反应2‑3小时，冷却，过滤得到过滤液；(3)纯化：将提取液真空浓缩之原体积的五分之一，使用大孔吸附树脂进行纯化。本发明综合运用木聚糖酶，莱鲍迪甙和甜菊糖甙可以有效缩短酶法处理的时间，并且在纯化过程中也可以保护丹酚酸B的活性，从而大幅度提高提取纯化过程中的丹酚酸B的稳定性。两者单独使用均有此效果，组合起来更有协同效果。
主设计要求
1.一种丹酚酸B的提取分离方法，其特征在于：运用了木聚糖酶，莱鲍迪甙和\/或甜菊糖甙；其步骤如下：(1)选取丹参药材：选取合乎药典规定的丹参药材饮片；(2)提取：按照重量份，称取丹参药材饮片1份，加入pH5.0的水12份，加入木聚糖酶，莱鲍迪甙和\/或甜菊糖甙，38-45℃反应2-3小时，冷却，过滤得到过滤液；(3)纯化：将提取液浓缩，使用大孔吸附树脂进行纯化。
设计方案
1.一种丹酚酸B的提取分离方法，其特征在于：运用了木聚糖酶，莱鲍迪甙和\/或甜菊糖甙；
其步骤如下：(1)选取丹参药材：选取合乎药典规定的丹参药材饮片；(2)提取：按照重量份，称取丹参药材饮片1份，加入pH5.0的水12份，加入木聚糖酶，莱鲍迪甙和\/或甜菊糖甙，38-45℃反应2-3小时，冷却，过滤得到过滤液；(3)纯化：将提取液浓缩，使用大孔吸附树脂进行纯化。
2.权利要求1所述的丹酚酸B的提取分离方法，其特征在于：加入每克药材5-15U的木聚糖酶。
3.权利要求1所述的丹酚酸B的提取分离方法，其特征在于：莱鲍迪甙0.02份和\/或甜菊糖甙0.02份。
4.权利要求1所述的丹酚酸B的提取分离方法，其特征在于：所述步骤(3)为：将提取液浓缩至原体积的五分之一。
5.权利要求1-4任一项所述的丹酚酸B的提取分离方法，其特征在于：所述步骤(3)为：乙醇浸泡树脂，使其充分溶胀，选用玻璃柱，使用乙醇冲洗树脂柱，洗去树脂中含带的有机杂质；先去离子水洗，盐酸溶液浸泡，放尽酸液，再用去离子水洗净，加入氢氧化钠溶液洗，再去离子水洗，除去树脂内水溶性杂质；使用乙醇的HCl 溶液冲洗树脂柱，提液上样，使用少量去离子水清洗，有效成分被吸附在大孔树脂内；用50％乙醇洗脱树脂柱，收集纯化的洗脱液，真空干燥溶液，得到产物。
6.权利要求5所述的丹酚酸B的提取分离方法，其特征在于：所述步骤(3)为：95％乙醇浸泡树脂18-20小时，使其充分溶胀，选用玻璃柱，使用95％乙醇冲洗树脂柱，洗去树脂中含带的有机杂质；先去离子水洗，5％盐酸溶液浸泡，放尽酸液，再用去离子水洗净，加入2-4％氢氧化钠溶液洗，再去离子水洗，除去树脂内水溶性杂质；使用50％乙醇的HCl 溶液冲洗树脂柱；提液上样，使用少量去离子水清洗，有效成分被吸附在大孔树脂内；用50％乙醇洗脱树脂柱，收集纯化的洗脱液，真空干燥溶液，得到产物。
设计说明书
技术领域
本发明涉及一种丹酚酸B的提取分离方法，属于生物工程技术领域。
背景技术
丹参，中药名。为唇形科植物丹参Salvia miltiorrhiza Bge.的干燥根和根茎。春、秋二季采挖，除去泥沙，干燥。全国大部分地区都有分布。具有活血祛瘀，通经止痛，清心除烦，凉血消痈之功效。用于胸痹心痛，脘腹胁痛，症瘕积聚，热痹疼痛，心烦不眠，月经不调，痛经经闭，疮疡肿痛。
对丹参有效成分的早期研究主要集中在脂溶性成分方面，现已得到40余种化合物。这些化合物可以分为两类，即丹参酮类(邻醌型)和罗列酮类(邻羟基对醌型)。丹参酮类化合物多数属于二萜化合物，其中大部分是二萜醌类化合物。如丹参酮I、丹参酮Ⅱ-A、丹参酮Ⅱ-B、丹参酮Ⅲ、异丹参酮I、异丹参酮Ⅱ-A、隐丹参酮、异隐丹参酮、羟基丹参酮Ⅱ-A、二氢丹参酮I、左旋二氢丹参酮I、丹参新醌甲、丹参新醌乙、丹参新醌丙、新隐丹参酮Ⅱ，环酚乳酰胺、油酰新隐丹参酮和油酰丹参新醌A等。经过几十年的努力，人们对丹参脂溶性成分获得了比较全面的认识，而且对各种成分的生物活性研究也取得了重要发现，证明了这些化合物的药理作用，开发出一批效果良好的临床应用药物。丹酚酸B为三分子丹参素与一分子咖啡酸结合而成。丹酚酸B为丹参中含量最高的水溶性酚酸成分,在丹参的药理作用中占有重要地位。但是,丹酚酸B因其化学结构不稳定,在水溶液中极易降解,各种降解产物又有复杂的药理活性。这不仅给丹参水溶性成分药物的制剂工艺带来了很大困难,且有可能降低其相关制剂的临床疗效。
丹参水提液中丹酚酸B湿热降解符合一级动力学,反应速率常数与加热温度、pH呈正相关关系,其中温度对反应速率常数K的影响大于pH的影响。因而,在提取分离丹酚酸B时应该缩短丹参浸泡、水提、浓缩和干燥的时间,避免在碱性条件下长时间加热,并且要尽量缩短溶液状态的存放时间,尽快使丹参水提液固体化可减少丹酚酸B损失。此外,应尽可能保证在低pH、高浓度和低温条件下保存,以保持水溶液中丹酚酸B稳定性。
目前，生物酶在中药技术中的应用愈加广泛，特别是在中药材的提取过程中，取得了显著的效果。酶反应需要一定的条件。在适宜条件下，酶的活性最强，表现出的催化能力最强。
本发明旨在提供一种环保高效的丹酚酸B的提取分离方法，在分离过程中丹酚酸B稳定性高，降解率低，并且充分利用生物技术，环保高效。
发明内容
本发明的目的是提供一种环保高效的丹酚酸B的提取分离方法，在分离过程中丹酚酸B稳定性高，降解率低，并且充分利用生物技术，环保高效。丹酚酸B的结构式如下：
甜叶菊糖是从甜菊叶中提取出来的一种高甜度.低热量的非营养型的天然甜味剂。目前，已从甜叶菊糖中发现了八种糖甙，即甜菊甙(slevioside)、莱鲍迪甙(RebaudiosideA、B、C、D、E)，杜尔可甙A(Dul～ide和斯替维伯甙(steviobi～siti)莱鲍迪甙A的甜度最高，大于蔗糖的300倍，而且味质最好，不含任何不良余味，是一种最为理想的天然甜昧剂，提取制备莱鲍迪甙A含量高的甜菊糖产品是国内外甜菊糖生产工业的研究热点.
甜菊糖甙(俗称甜菊糖、甜菊糖苷)是一种从菊科草本植物甜叶菊(或称甜菊叶)中精提的新型天然甜味剂，而南美洲使用甜叶菊作为药草和代糖已经有几百年历史。
本申请人第一次将莱鲍迪甙和甜菊糖甙运用于丹酚酸B的提取分离中，运用莱鲍迪甙和甜菊糖甙可以有效缩短酶法处理的时间，并且在纯化过程中也可以保护丹酚酸B的活性，从而大幅度提高提取纯化过程中的丹酚酸B的稳定性。两者单独使用均有此效果，组合起来更有协同效果。
本发明所需要解决的技术问题可以通过以下技术方案来实现。
一种丹酚酸B的提取分离方法，其步骤如下：
(1)选取丹参药材：选取合乎药典规定的丹参药材饮片；
(2)提取：按照重量份，称取丹参药材饮片1份，加入pH5.0的水12份，加入每克药材5-15U的木聚糖酶，莱鲍迪甙和\/或甜菊糖甙，38-45℃反应2-3小时，冷却，过滤得到过滤液；
(3)纯化：将提取液真空浓缩之原体积的五分之一，使用大孔吸附树脂进行纯化。
作为优选，所述步骤(3)为：
95％乙醇浸泡树脂18-20小时，使其充分溶胀，选用玻璃柱，使用95％乙醇冲洗树脂柱，洗去树脂中含带的有机杂质。先去离子水洗，5％盐酸溶液浸泡，放尽酸液，再用去离子水洗净，加入2-4％氢氧化钠溶液洗，再去离子水洗，除去树脂内水溶性杂质。使用50％乙醇的HCL溶液冲洗树脂柱。提液上样，使用少量去离子水清洗，有效成分被吸附在大孔树脂内。用50％乙醇洗脱树脂柱，收集纯化的洗脱液，真空干燥溶液，得到产物。
本发明的优点：
(1)本发明综合运用木聚糖酶，莱鲍迪甙和甜菊糖甙可以有效缩短酶法处理的时间，并且在纯化过程中也可以保护丹酚酸B的活性，从而大幅度提高提取纯化过程中的丹酚酸B的稳定性。两者单独使用均有此效果，组合起来更有协同效果。
(2)直接从丹参药材饮片出发，不需要粉碎，一步即可获得提取率很高的提取液。
具体实施方式
下面详细描述本发明的实施例，所述实施例仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。
本发明的具体实施例如以下说明。
本发明使用现有技术常规HPLC检测有效含量和提取率：
精确称取丹酚酸B标准品2.83毫克，置于5毫升容量瓶中，去离子水定容，摇匀，作为对照品溶液。
按照药典方法：流动相为甲醇-乙腈-甲酸-水(30：10：1：59)。检测波长为286nm。对照品溶液进样量分别为1、2、4、8、16μL，依次进行高效液相色谱检测。以峰面积为纵坐标，进样量为横坐标，绘制标准曲线。
按照甲醇回流提取率作为参照：取丹参药材若干，粉碎，过100目筛，取药材粉末1克，加入75％甲醇250毫升，称定重量，加热回流1小时，取出，冷却，用75％甲醇补足重量，摇匀，过滤得到滤液。
样品含量的测试：进样量为5μl，进样检测，根据标准曲线计算得到生药中丹酚酸B的含量为3.58％。
实施例1
一种丹酚酸B的提取分离方法，其步骤如下：
(1)选取丹参药材：选取合乎药典规定的丹参药材饮片；
(2)提取：按照重量份，称取丹参药材饮片50g，加入pH5.0的水600g，加入每克药材10U的木聚糖酶，莱鲍迪甙1g，40℃反应3小时，冷却，过滤得到过滤液；
补足液体，根据标准曲线计算得到丹酚酸B的提取率为3.68％。
(3)纯化：将提取液真空浓缩之原体积的五分之一，使用大孔吸附树脂进行纯化。
所述步骤(3)为：
95％乙醇浸泡树脂18小时，使其充分溶胀，选用玻璃柱，使用95％乙醇冲洗树脂柱，洗去树脂中含带的有机杂质。先去离子水洗，5％盐酸溶液浸泡，放尽酸液，再用去离子水洗净，加入2％氢氧化钠溶液洗，再去离子水洗，除去树脂内水溶性杂质。使用50％乙醇的HCL溶液冲洗树脂柱。提液上样，使用少量去离子水清洗，有效成分被吸附在大孔树脂内。用50％乙醇洗脱树脂柱，收集纯化的洗脱液，真空干燥溶液，得到产物。
实施例2：
一种丹酚酸B的提取分离方法，其步骤如下：
(1)选取丹参药材：选取合乎药典规定的丹参药材饮片；
(2)提取：按照重量份，称取丹参药材饮片50g，加入pH5.0的水600份，加入每克药材12U的木聚糖酶，甜菊糖甙1g，45℃反应3小时，冷却，过滤得到过滤液；
补足液体，根据标准曲线计算得到丹酚酸B的提取率为3.61％。
(3)纯化：将提取液真空浓缩之原体积的五分之一，使用大孔吸附树脂进行纯化。
所述步骤(3)为：
95％乙醇浸泡树脂18小时，使其充分溶胀，选用玻璃柱，使用95％乙醇冲洗树脂柱，洗去树脂中含带的有机杂质。先去离子水洗，5％盐酸溶液浸泡，放尽酸液，再用去离子水洗净，加入3％氢氧化钠溶液洗，再去离子水洗，除去树脂内水溶性杂质。使用50％乙醇的HCL溶液冲洗树脂柱。提液上样，使用少量去离子水清洗，有效成分被吸附在大孔树脂内。用50％乙醇洗脱树脂柱，收集纯化的洗脱液，真空干燥溶液，得到产物。
实施例3
一种丹酚酸B的提取分离方法，其步骤如下：
(1)选取丹参药材：选取合乎药典规定的丹参药材饮片；
(2)提取：按照重量份，称取丹参药材饮片50g，加入pH5.0的水600g，加入每克药材10U的木聚糖酶，莱鲍迪甙1g，甜菊糖甙1g，45℃反应2小时，冷却，过滤得到过滤液；
补足液体，根据标准曲线计算得到丹酚酸B的提取率为3.86％。
(3)纯化：将提取液真空浓缩之原体积的五分之一，使用大孔吸附树脂进行纯化。
作为优选，所述步骤(3)为：
95％乙醇浸泡树脂18小时，使其充分溶胀，选用玻璃柱，使用95％乙醇冲洗树脂柱，洗去树脂中含带的有机杂质。先去离子水洗，5％盐酸溶液浸泡，放尽酸液，再用去离子水洗净，加入3％氢氧化钠溶液洗，再去离子水洗，除去树脂内水溶性杂质。使用50％乙醇的HCL溶液冲洗树脂柱。提液上样，使用少量去离子水清洗，有效成分被吸附在大孔树脂内。用50％乙醇洗脱树脂柱，收集纯化的洗脱液，真空干燥溶液，得到产物。
实施例4
考察不加入莱鲍迪甙和甜菊糖甙的情况：
对照试验1：
一种丹酚酸B的提取分离方法，其步骤如下：
(1)选取丹参药材：选取合乎药典规定的丹参药材饮片；
(2)提取：按照重量份，称取丹参药材饮片1份，加入pH5.0的水20份，加入每克药材10U的木聚糖酶45℃反应3小时，冷却，过滤得到过滤液；
补足液体，根据标准曲线计算得到丹酚酸B的提取率为2.36％。
对照试验2：
一种丹酚酸B的提取分离方法，其步骤如下：
(1)选取丹参药材：选取合乎药典规定的丹参药材饮片；
(2)提取：按照重量份，称取丹参药材饮片1份，加入pH5.0的水20份，加入每克药材10U的木聚糖酶45℃反应8小时，冷却，过滤得到过滤液；
补足液体，根据标准曲线计算得到丹酚酸B的提取率为2.95％，可见，延长时间后丹酚酸B的提取率提高，证明本发明运用莱鲍迪甙和甜菊糖甙可以有效缩短酶法处理的时间。
实施例5最终损失率检测
洗脱液真空干燥，得到棕色粉末，取粉末0.1克，溶于20毫升去离子水中，按照标准曲线测试含量。
申请码:申请号:CN201910059866.2 申请日:2019-01-22 公开号:公开日:国家:CN 国家/省市:84(南京) 授权编号:CN109810082B 授权时间:20190927 主分类号:C07D 307/84 专利分类号:C07D307/84 范畴分类:18D; 申请人:南京泽朗生物科技有限公司 第一申请人:南京泽朗生物科技有限公司 申请人地址:211200 江苏省南京市溧水区白马镇工业集中区 发明人:刘东锋;于霞 第一发明人:刘东锋 当前权利人:南京泽朗生物科技有限公司 代理人:乔浩刚 代理机构:11530 代理机构编号:北京华识知识产权代理有限公司 优先权:关键词:当前状态:审核中 类型名称:外观设计
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