导读:本文包含了萤火虫荧光素酶论文开题报告文献综述及选题提纲参考文献，主要关键词:萤火虫荧光素酶,凋亡,Caspase-3
萤火虫荧光素酶论文文献综述
车路平,栗永华,杨斌,徐智凯,廖瑛[1]（2019）在《基于萤火虫荧光素酶报告基因检测凋亡的系统构建及鉴定》一文中研究指出为构建一个能够快速检测凋亡的含荧光素酶报告基因(Fluc)的真核表达质粒,采用PCR的方法将Caspase-3的识别基序Asp-Glu-Val-Asp(DEVD)四个氨基酸引入至Fluc基因的C端和N端之间;同时选取Asp-Glu-Val-Gly (DEVG)四个氨基酸作为阴性对照。随后重组片段分别克隆至分离型内含肽的N端和C端之间,并命名为pFluc-DEVD和pFluc-DEVG。将该表达质粒与海肾荧光素酶报告质粒(RLUC)同时转染至HeLa细胞,通过双荧光素酶报告基因和Western blotting实验检测细胞凋亡水平。双荧光素酶报告基因系统实验结果显示,当发生凋亡时,pFluc-DEVD质粒组表达的萤火虫荧光素酶的含量高出pFluc-DEVG质粒组约3倍。Western blotting检测结果显示,转染pFluc-DEVD质粒的细胞在凋亡药物刺激后,Fluc活化的蛋白显着增多,且Caspase-3的活化程度与Fluc的表达呈正相关,并有显着的统计学差异。以上结果表明,pFluc-DEVD真核表达质粒表达的萤火虫荧光素酶蛋白能被细胞内的Caspase-3酶裂解,且该质粒能够精确地反映出细胞的凋亡水平,为后续进行凋亡定量检测提供了一个可借鉴的方法。(本文来源于《生物工程学报》期刊2019年08期）
房佩佩[2]（2018）在《定点突变提高萤火虫荧光素酶催化活力的研究》一文中研究指出萤火虫荧光素酶催化的发光反应是一个双底物反应,其基本的生物化学反应过程是虫荧光素酶在氧气和Mg~(2+)参与下,催化荧光素生成氧化荧光素,发射可见光。该反应发光强度与ATP浓度在一定的浓度范围内正相关。ATP广泛且稳定存在于生命体细胞中,其含量可以指示食品及加工环境中微生物的数量,因此萤火虫荧光素酶可以用于食品生产过程及食品成品微生物指标的快速检测。此外,萤火虫荧光素酶也可应用于细胞的代谢研究、生物传感器、药物筛选等领域。因此获得性质稳定、发光性能优良的萤火虫荧光素酶对于实际生产和生活都具有十分重要的意义。本研究旨在构建能够高效表达和纯化的高酶活虫荧光素酶突变体,对突变体酶和野生型酶的酶学性质进行比较,探究酶的稳定剂对酶催化活力的影响,并尝试在枯草芽孢杆菌中表达萤火虫荧光素酶。首先,本研究将野生型北美萤火虫荧光素酶Luc的423位异亮氨酸,436位天冬氨酸,530位亮氨酸分别突变为亮氨酸、甘氨酸、精氨酸,构建突变型萤火虫荧光素酶Luc1.1的表达菌株E.coli BL21(DE3,pET30a-luc1.1)。为研究突变型Luc1.1的性质特点,测定其酶活为野生型Luc的11.62倍,催化发光的最大发射波长相对于野生型红移了6 nm;温度及pH对酶活的影响研究,结果表明野生型和突变型萤火虫荧光素酶在pH 7.5时酶活达到最大值,pH变化时酶催化发光的最大发射波长发生轻微变化:野生型Luc催化发光的最大发射波长随pH变化波动小,突变型Luc1.1在体系为中性或偏碱性时,催化发光的最大发射波长明显红移;保存温度的升高时,两种酶的活力均有所下降,但突变型Luc1.1酶活在30℃后下降速率较慢而表现出稍好的热稳定性。其次,为实现萤火虫荧光素酶在枯草芽孢杆菌中的表达,分别构建枯草芽孢杆菌重组菌B.subtilis WB800(pMA0911-luc)及B.subtilis WB800(pMA0911-luc1.1)表达野生型Luc及突变型Luc1.1。实验测定结果表明萤火虫荧光素酶在枯草芽孢杆菌中的表达量下降55%左右,酶活大小与大肠杆菌工程中表达的酶基本一致。第叁,将突变型萤火虫荧光素酶Luc1.1进行单点饱和突变,突变位点为423位、436位及530位,突变氨基酸残基类型为除突变型Luc1.1以外的其他19种氨基酸,共获得57个虫荧光素酶突变体。分别将各个突变体酶诱导表达、纯化和定量,测定酶活力与野生型Luc酶活进行比较,结果表明:用具有非极性侧链的疏水性氨基酸如Val、Met代替Luc1.1的423位Leu,用具有较小侧链氨基酸如Ala、Cys、Ser替换436位Gly,用带正电的氨基酸如Lys、His替换530位Arg,均能够提高萤火虫荧光素酶的催化效率;通过饱和突变共获得高于野生型Luc酶活10倍以上的虫荧光素酶突变体8个,将Luc1.1的436位Gly替换为Ala、Cys、Ser的突变体酶的活力可达到野生型22.60倍、21.37倍、19.96倍。本实验还将高酶活的萤火虫荧光素酶突变体与市售产品相比较,结果表明突变体酶的催化活力已高于国内多个厂家市售萤火虫荧光素酶。最后,研究了四种稳定剂对于突变型Luc1.2(虫荧光素酶Luc1.1的436位替换为Ala的突变体)的酶活增强作用和催化发光反应的动力学特点改善作用。结果表明,对于Luc1.2的催化反应体系,辅酶A(CoA)、焦磷酸钾(PPiK)、叁磷酸钠(STPP)及5′-叁磷酸肌苷叁钠(ITP)增强发光作用的最适浓度分别为1.0 mmol/L、0.08 mmol/L、1.0 mmol/L、0.8 mmol/L。添加最适浓度的CoA可将突变体Luc1.2催化体系的相对发光强度提高至野生型Luc未添加增强剂反应体系的47.2倍左右,添加最适浓度的STPP可增强至31.6倍左右,PPiK和ITP对Luc1.2催化体系也具有一定的增强相对发光强度的作用。测定添加最适浓度试剂时的虫荧光素酶Luc1.2催化体系的发光体系的动力学特点,结果表明对体系稳定效果最好的为CoA,作用效果为反应开始后15 s内酶活保持80%左右,其他叁种物质STPP、PPiK、ITP可使发光强度在5 s内酶活保持80%左右。(本文来源于《江南大学》期刊2018-06-01）
罗展浩[3]（2018）在《北美萤火虫荧光素酶在毕赤酵母中的表达、纯化及其特性研究》一文中研究指出食品安全问题是全球人类共同面对的和亟待解决的难题之一,其中控制由微生物污染造成的食品安全问题,又是其中最重要的一项议题。ATP快速检测技术,能对食品的微生物ATP提取和检测,能够在几十分钟内,获取污染微生物的检测结果。荧光素酶则是ATP快速检测技术的核心组件,因此该酶的需求与日俱增。北美萤火虫荧光素酶,是商业化的荧光素酶,通常用作报告基因或活体生物荧光成像技术,也用于ATP快速检测。已有大肠杆菌生产该荧光素酶的相关研究,但是该系统不能将酶直接分泌到胞外,而且培养过程需要添加抗生素维持遗传特性,单位体积发酵液产量不高等。据此本研究旨在将常用的北美萤火虫荧光素酶,使用毕赤酵母这真核系统解决此类问题,以期为最终规模化制备荧光素酶提供理论和技术支持。首先,根据北美萤火虫(Photinus pyralis)的序列,设计引物从报告基因载体pGL2-control上克隆荧光素酶基因luc,构建诱导型表达载体pPIC9K-luc和pPICZαA-lucM,并且转化其宿主Pichia pastoris GS115获得高效表达荧光素酶的重组菌GS115/pPIC9K-luc和GS115/pPICZαA-lucM,胞外、胞内具有较高的荧光素酶活性。SDS-PAGE鉴定荧光素酶的分子量分别为70 kD和75 kD。利用超滤、阴离子交换层析和分子筛层析纯化无标签的荧光素酶(前者表达株),获得68 mg/L产量的荧光素酶,回收率为35%(胞外)、33%(胞内),最大酶比活可达7.00×10~8 RLU/mg;利用镍亲和层析柱和超滤纯化带组氨酸标签的荧光素酶(后者表达株),获得88 mg/L产量的荧光素酶,回收率为55%(胞外)和53%(胞内),最大比活达到7.12×10~9 RLU/mg。继而对纯化的带标签的荧光素酶进行去糖基化分析、基本酶学特性分析,发光体系优化和稳定性等进行了初步研究。发现该酶的糖基化程度为13.3%,酶对底物ATP和荧光素的结合常数Km分别为100μmol/L和17.5μmol/L,最小能够检出1 fmol的ATP,最适反应温度为34℃,最适反应pH为7.8。同时考察了100μl反应体系中底物荧光素、发光增强剂DEAE-dx、α-环糊精、Mg~(2+)的最佳浓度为0.035 mmol/L、0.04%、0.2%、0.15 mmol/L,发光强度提高2.7倍。在上述基础上,最后考察了海藻糖、DTT、甘油和BSA对酶的保护作用,最佳保护浓度为0.2 mmol/L、0.5 mmol/L、5%、1%,保护效率为75%。本研究成功地使用毕赤酵母表达系统,对荧光素酶进行了表达、纯化,并且完成酶的基本特性和稳定性分析研究,为日后规模化生产奠定基础。(本文来源于《华南理工大学》期刊2018-04-14）
程媛媛,刘亚军[4]（2016）在《萤火虫荧光素分子和荧光素酶修饰的理论研究》一文中研究指出荧光素-荧光素酶生物发光体系在生物检测、体内成像等领域都获得了重要应用。为了提高检测水平和扩大应用范围,实验上合成了一些荧光素分子类似物~([1,2])并对野生萤火虫的荧光素酶进行改造~([3,4])。本文在TD CAM-B3LYP/6-31+G**计算水平上研究了一系列氧化荧光素分子类似物的发光性质,以期认识取代基效应对发光的影响。同时,对已有晶体结构的荧光素酶进行改造并进行分子动力学模拟,利用量子力学和分子力学相结合的方法预测荧光素分子在突变体中的发光性质,以探索荧光素酶突变体对发光性质的影响。基于以上研究,我们设计了一个具有近红外发光的荧光素分子类似物。(本文来源于《中国化学会第30届学术年会摘要集-第十八分会：电子结构理论方法的发展与应用》期刊2016-07-01）
陈浮,刘树深,余沫,李恺[5]（2015）在《基于咪唑离子液体与萤火虫荧光素酶的结合模式预测混合物毒性》一文中研究指出混合物毒性的评估与预测一直是毒理学和环境科学领域的前沿和热点.浓度加和模型(CA)和独立作用模型(IA)是目前应用最多的2个加和参考模型.但是,由于作用模式的相似性或相异性难以确定,难以在实际工作中选择合适的参考模型.为了探索分子水平上的结合模式与加和模型的关系,本研究以4种1-烷基-3-甲基咪唑氯离子液体([Cnmim]Cl,n=2,6,8,12)和萤火虫荧光素酶为研究对象,采用分子对接和分子动力学模拟确定离子液体与萤火虫荧光素酶的结合模式,结果表明[C2mim]Cl和[C6mim]Cl与荧光素酶具有相似的结合模式(BP1和BP2),[C8mim]Cl和[C12mim]Cl具有相同的结合模式(BP3).通过荧光素酶微板毒性分析法测定4个离子液体及两两组合构成的6个二元混合物体系共18条混合物射线的发光抑制毒性,应用CA和IA模型评估混合物毒性.结果表明,具有不同结合模式的[C2mim]Cl-[C8mim]Cl和[C2mim]Cl-[C12mim]Cl混合物体系,其毒性可用IA预测;具有相同结合模式的[C2mim]Cl-[C6mim]Cl和[C8mim]Cl-[C12mim]Cl体系,其毒性可用CA预测;而[C6mim]Cl-[C8mim]Cl和[C6mim]Cl-[C12mim]Cl体系,其部分混合物毒性可用CA描述,因其组分的结合模式既有相似性又有相异性.(本文来源于《科学通报》期刊2015年19期）
施俊伟[6]（2015）在《基于萤火虫荧光素酶的凋亡检测方法的建立及其在筛选结核分枝杆菌蛋白调控细胞凋亡中的应用》一文中研究指出结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)简称结核杆菌,是结核病的病原菌,目前世界上约1/3的人口感染结核分枝杆菌,其中5%-10%的感染者将发展成为活动性结核病,全球每年新增结核病患者约880万,死亡约300万。细胞凋亡是细胞发生的一种程序性死亡,在组织分化、器官发育、机体稳态等生理过程中发挥着重要作用。尽管细胞凋亡是一种正常的生理现象,但是异常的细胞凋亡常引起许多疾病。调节宿主细胞凋亡是结核分枝杆菌致病性的一部分,影响结核分枝杆菌的生存、繁殖、扩散等过程。快速准确的检测细胞凋亡是研究凋亡相关机制以及评价凋亡对疾病过程影响的基础。Caspase-3的激活是细胞凋亡的重要标志,常被应用于凋亡检测方法的建立。为了方便快速的检测结核分枝杆菌蛋白对细胞凋亡的影响,本研究将caspase-3的识别序列与萤火虫荧光素酶融合表达构建了一个新型的caspase-3报告质粒,用于细胞凋亡的检测,并筛选了部分结核分枝杆菌编码的蛋白,具体研究内容如下:1.Caspase-3报告质粒的构建及验证本研究构建了四种caspase-3报告质粒,将四种报告质粒分别转染He La细胞,在细胞凋亡阳性刺激物刺激下,四种报告质粒荧光素酶的值明显增加,同时荧光素酶被切割,说明报告质粒构建成功。细胞凋亡发生时,233-Dna E-DEVDG激活超过25倍,其对照的值处于较低水平,而另外叁种报告质粒和相应对照的值同时升高。这些结果说明233-Dna E-DEVDG背景值低、敏感性高,更适合应用于检测细胞凋亡。2.结核分枝杆菌ESAT-6家族蛋白的筛选将结核分枝杆菌ESAT-6蛋白家族真核表达质粒、233-Dna E-DEVDG和TK共转染He La细胞,通过双荧光素酶试验检测结核分枝杆菌ESAT-6蛋白家族成员对细胞凋亡的影响。实验发现esx A、esx T和esx L能激活233-Dna E-DEVDG并呈剂量依赖性,esx C不能激活233-Dna E-DEVDG。3.筛选结果的验证为了验证筛选结果的可靠性,本研究通过经典的细胞凋亡检测方法验证。Caspase-3在细胞凋亡相关通路中处于中心位置,是评价细胞凋亡的核心指标。本研究通过Western Blot检测发现esx A和esx T可以促进caspase-3的活化,阴性对照esx C不能促进caspase-3的活化;细胞凋亡检测试剂盒染色后,通过流式细胞仪检测发现esx A和esx T可以上调凋亡细胞比率。4.核因子-kB(NF-kB)参与esx T诱导的细胞凋亡NF-kB通路与细胞凋亡密切相关,在一定情况下,NF-kB激活是细胞凋亡所必须的。为探究NF-kB通路是否参与esx T诱导的细胞凋亡,本研究通过双荧光素酶试验检测发现esx T能激活NF-kB启动子并呈剂量依赖性,用BAY11抑制NF-kB的激活会导致esx T诱导的细胞凋亡水平部分下降,说明NF-kB的激活参与了esx T诱导的细胞凋亡。NF-kB通路主要通过促进其下游的促凋亡基因表达促进细胞凋亡,为进一步寻找esx T通过NF-kB调控了哪些促凋亡基因的表达,本研究通过Real-Time PCR和Western Blot检测发现esx T能在m RNA和蛋白水平上调肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和肿瘤坏死因子相关的凋亡诱导配体(TRAIL)的表达。这些结果说明esx T可能通过NF-kB上调其下游的TNF-α和TRAIL促进细胞凋亡。(本文来源于《华中农业大学》期刊2015-06-01）
申梁[7]（2014）在《稳定表达萤火虫荧光素酶报告基因的猪瘟病毒的构建及其在抗病毒试验中的应用》一文中研究指出猪瘟病毒(Classical swine fever virus, CSFV)是猪瘟(Classical swine fever, CSF)的病原,猪瘟对养猪业的危害巨大,常造成重大经济损失,也是我国计划要消灭的重大动物疫病之一。目前,对猪瘟疫情的防控主要是通过疫苗接种和对感染猪瘟病毒的猪进行严格扑杀和对周边地区进行消毒防疫。我国在国家中长期动物疫病防治规划(2012—2020年)中将猪瘟列入优先防治的6种动物疫病之一,并计划进一步扩大猪瘟净化区域。为了快速检测CSFV抗体效价,判断疫苗免疫状况,建立针对CSFV特异性抑制剂的高通量筛选方法。本研究利用反向遗传学技术拯救了一株能够稳定表达萤火虫荧光素酶(Firefly luciferase, Flue)基因的猪瘟报告病毒CSFV-Npro Fluc通过重迭PCR的方法将Fhuc基因克隆到基于RNA聚合酶Ⅱ的Shimen株全长感染性cDNA克隆pBRCISM的Npro编码区内。经RT-PCR、抗原捕获ELISA、间接免疫荧光试验(IFA)和实时荧光定量PCR (real-time-PCR)检测显示病毒构建成功。测定病毒生长曲线后发现该报告病毒与亲本病毒Shimen株相比病毒滴度下降了近10倍。在连续传代的过程中发现该报告病毒所携带的Fluc基因并没有发生丢失,且病毒在传代的过程中感染性基本没有发生变化,证明了该报告病毒的稳定性。通过检测SK6细胞在感染报告病毒后不同时间点Fluc活性后发现CSFV的侵入过程相当迅速,最早可在感染报告病毒后4.5h内通过Fluc活性检测到CSFV Npro蛋白的表达。此外,研究证实通过检测Fluc活性值与直接用Western blot检测Npro蛋白表达量结果一致。为了进一步证明该病毒可以用于抗体效价测定以及抗病毒抑制剂的筛选,我们用该报告病毒对本实验室免疫攻毒后的50份血清进行了中和试验,同时用该报告病毒筛选了12个针对CSFV基因组不同区域的siRNA的干扰效果。结果表明,该报告病毒可以用于快速检测免疫血清的抗体滴度并且成功的筛选出了3个对CSFV的复制具有较强的干扰效果siRNA分子。总之,本研究首次构建了携带Fluc报告基因的重组CSFV,并证明了该报告病毒CSFV-Npro Fluc不仅可以用于抗体效价的快速测定,还可以作为筛选CSFV特异性抑制剂的有效工具。(本文来源于《中国农业科学院》期刊2014-05-01）
康洋[8]（2013）在《意大利萤火虫荧光素酶的原核表达、纯化及酶稳定性研究》一文中研究指出微生物污染与我们的生活息息相关，传统微生物污染检测需要专业人员，特定实验室，而且还需要48小时的时间才能检测出结果，由于上述方法受时间、地点、人员等多方面因素限制，随着人们对食品药品以及公共场所卫生的重视，因此开发出安全快速检测方法势在必行。目前大多数科研机构或企业采用的是北美萤火虫荧光素酶，针对该酶的稳定性差，灵敏度低，衰减周期短等缺点，本课题旨在进行另一种意大利萤火虫荧光素酶的基因工程研究。首先，根据Luciola italica荧光素酶在Genbank中的编码基因序列，构建了诱导型表达载体pET28a-Luc，并转化其宿主菌E. coli BL21（DE3）获得高效诱导表达萤火虫荧光素酶基因的重组菌E. coli BL21（DE3）/pET28a-Luc。SDS-PAGE电泳分析显示:重组蛋白的相对分子量为63kD，表达量占全菌胞内可溶性蛋白的30%。利用表达载体pET28a上的His-Tag标记选用Ni柱纯化重组荧光素酶（LUC），纯化后比酶活达到8×109RFU/mg，回收率为80%。继而，对影响该酶稳定性、半衰期和发光强度的诸因素进行了初步研究，确定ATP检测极限为10E-10，意大利萤火虫荧光素酶催化发光的各成分的组成为：荧光素10μL（浓度100mg/L），MgCl28μL（浓度5mmol/L），最佳反应温度是35℃，缓冲液的最佳pH值为7.8。在上述催化体系基础上，本课题考察了甘油、聚乙二醇、甜菜碱、海藻糖、DTT、BSA、蔗糖对意大利萤火虫荧光素酶的稳定作用。通过单因素实验研究，最终确定的保护剂最佳用量为：甜菜碱10%，聚乙二醇5%，BSA25μg/mL，DTT0.8mmol/L，蔗糖10%，甘油20%，海藻糖0.08mol/L。最后，本实验还通过对不同的缓冲液、盐离子、氨基酸和pH研究，确定了能够延长半衰期的缓冲液配比。(本文来源于《天津大学》期刊2013-11-01）
常超,王琨,王凌,伍金娥[9]（2013）在《基于萤火虫荧光素酶ATP生物发光法灵敏度的研究进展》一文中研究指出在工业化制造过程中,对微生物总数的监测至关重要,尤其是在食品、药品、电子和化妆品等产业。基于萤火虫荧光素酶的ATP生物发光法是一种快速、简便的方法。尽管在上述领域中有部分认可,但由于该法存在对环境的敏感性、微生物的检测限偏高、缺乏检测结果 RLU的标准等局限性,限制其更为广泛的应用。该研究综合分析了该方法的原理、检测步骤、存在的问题,讨论了通过ATP提取方法、提高荧光素酶活性稳定性、引入扩增体系的研究作为提高方法的灵敏度的切入点,并综述了国内外在此方面的研究进展,为研制更稳定、更精确的生物发光方法提供思路。(本文来源于《安徽农业科学》期刊2013年24期）
王玢瑸[10]（2013）在《表达萤火虫荧光素酶报告基因的兔出血症病毒复制子的构建与应用》一文中研究指出【目的】兔病毒性出血症是发生于兔的一种急性、热性和致死性传染病，它对世界养兔业构成了严重威胁。加强对该病病原的基础和应用研究，可以为该病的综合防治提供理论依据和技术支撑。由于兔出血症病毒(Rabbit hemorrhagic disease virus,RHDV)缺乏在体外增殖培养的细胞系，这严重阻碍了其分子生物学的基础研究。近年来，在杯状病毒科其它成员的研究中发现，该科病毒与其他正链RNA病毒在蛋白翻译起始与调控方面存在明显差异，猜测杯状病毒科病毒(包括RHDV)可能采用了一种新颖的翻译起始和调控机制，本文即利用反向遗传学技术对RHDV的翻译起始机制进行探讨性研究。【方法】（1）以RHDV JX/97株基因组全长cDNA克隆为模板，用PCR方法扩增RHDVVPg蛋白编码基因，将其克隆至原核表达载体pET-30a(+)中，转化大肠杆菌BL21(DE3)菌株，用IPTG诱导,使之高效表达。表达产物经镍柱纯化后免疫试验兔，制备抗VPg的多克隆抗体，用Western blot试验检测其特异性。（2）在RHDV全长基因组cDNA分子克隆的基础上，构建基于DNA质粒的含有萤火虫荧光素酶（firefly luciferase，Fluc）的病毒复制子，即用Fluc基因替换病毒结构蛋白编码区，依靠CMV启动子在哺乳动物细胞中进行转录和表达。利用RT-PCR、间接免疫荧光、Fluc活性分析和绘制复制子的动力曲线等方法检测复制子的表达情况；在此基础上，分别构建了缺失RHDV5'NCR(5'non-coding regions)，VPg和3D基因的复制子突变体，然后通过检测Fluc活性的变化,分析上述缺失突变对复制子蛋白表达的影响；为了进一步分析5’NCR和VPg基因的功能，我们在缺失3D基因的基础上，又分别构建了缺失5'NCR和VPg的双突变复制子，以qRT-PCR方法评价复制子在RNA水平的表达情况，以双荧光报告系统分析复制子在蛋白质水平的表达情况。最后，综合上述研究结果，初步确定与RHDV翻译相关因素。【结果】（1）构建了pET30a/VPg原核表达质粒，转化大肠杆菌BL21菌株后，成功表达了VPg蛋白；将该蛋白免疫试验兔后，成功并制备了特异性良好的多克隆抗体，为进一步研究RHDV的表达和调控机制提供了良好物质材料。（2）成功构建了携带萤火虫荧光素酶报告基因的兔出血症病毒复制子，用多种方法证明了该复制子能在RK13细胞中良好复制和表达；一步生长曲线分析表明，复制子在转染后24h表达达到峰值，随后逐渐下降；用反向遗传学技术证明了VPg，5'NCR和3D的缺失突变均能影响复制子表达，且以VPg影响最为显着；5'NCR和VPg对复制子mRNA水平的影响虽较小，但缺失突变体的蛋白表达水平差异却很显着，提示VPg和5'NCR与RHDV的蛋白翻译密切相关。【结论】（1）本研究表达的VPg蛋白，以及制备的特异性多克隆抗体为研究VPg的生物学功能奠定了基础；（2）本研究成功构建了携带荧光素酶基因的RHDV复制子，它在RK13细胞中能够良好复制和表达，为进一步研究RHDV的复制和翻译机制提供了良好的技术平台；（3）本研究利用反向遗传学技术证明RHDV的5'NCR,VPg和3D基因的缺失能下调报告基因的表达，初步揭示VPg和5'NCR与病毒的翻译相关。(本文来源于《西北农林科技大学》期刊2013-05-01）
萤火虫荧光素酶论文开题报告
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
萤火虫荧光素酶催化的发光反应是一个双底物反应,其基本的生物化学反应过程是虫荧光素酶在氧气和Mg~(2+)参与下,催化荧光素生成氧化荧光素,发射可见光。该反应发光强度与ATP浓度在一定的浓度范围内正相关。ATP广泛且稳定存在于生命体细胞中,其含量可以指示食品及加工环境中微生物的数量,因此萤火虫荧光素酶可以用于食品生产过程及食品成品微生物指标的快速检测。此外,萤火虫荧光素酶也可应用于细胞的代谢研究、生物传感器、药物筛选等领域。因此获得性质稳定、发光性能优良的萤火虫荧光素酶对于实际生产和生活都具有十分重要的意义。本研究旨在构建能够高效表达和纯化的高酶活虫荧光素酶突变体,对突变体酶和野生型酶的酶学性质进行比较,探究酶的稳定剂对酶催化活力的影响,并尝试在枯草芽孢杆菌中表达萤火虫荧光素酶。首先,本研究将野生型北美萤火虫荧光素酶Luc的423位异亮氨酸,436位天冬氨酸,530位亮氨酸分别突变为亮氨酸、甘氨酸、精氨酸,构建突变型萤火虫荧光素酶Luc1.1的表达菌株E.coli BL21(DE3,pET30a-luc1.1)。为研究突变型Luc1.1的性质特点,测定其酶活为野生型Luc的11.62倍,催化发光的最大发射波长相对于野生型红移了6 nm;温度及pH对酶活的影响研究,结果表明野生型和突变型萤火虫荧光素酶在pH 7.5时酶活达到最大值,pH变化时酶催化发光的最大发射波长发生轻微变化:野生型Luc催化发光的最大发射波长随pH变化波动小,突变型Luc1.1在体系为中性或偏碱性时,催化发光的最大发射波长明显红移;保存温度的升高时,两种酶的活力均有所下降,但突变型Luc1.1酶活在30℃后下降速率较慢而表现出稍好的热稳定性。其次,为实现萤火虫荧光素酶在枯草芽孢杆菌中的表达,分别构建枯草芽孢杆菌重组菌B.subtilis WB800(pMA0911-luc)及B.subtilis WB800(pMA0911-luc1.1)表达野生型Luc及突变型Luc1.1。实验测定结果表明萤火虫荧光素酶在枯草芽孢杆菌中的表达量下降55%左右,酶活大小与大肠杆菌工程中表达的酶基本一致。第叁,将突变型萤火虫荧光素酶Luc1.1进行单点饱和突变,突变位点为423位、436位及530位,突变氨基酸残基类型为除突变型Luc1.1以外的其他19种氨基酸,共获得57个虫荧光素酶突变体。分别将各个突变体酶诱导表达、纯化和定量,测定酶活力与野生型Luc酶活进行比较,结果表明:用具有非极性侧链的疏水性氨基酸如Val、Met代替Luc1.1的423位Leu,用具有较小侧链氨基酸如Ala、Cys、Ser替换436位Gly,用带正电的氨基酸如Lys、His替换530位Arg,均能够提高萤火虫荧光素酶的催化效率;通过饱和突变共获得高于野生型Luc酶活10倍以上的虫荧光素酶突变体8个,将Luc1.1的436位Gly替换为Ala、Cys、Ser的突变体酶的活力可达到野生型22.60倍、21.37倍、19.96倍。本实验还将高酶活的萤火虫荧光素酶突变体与市售产品相比较,结果表明突变体酶的催化活力已高于国内多个厂家市售萤火虫荧光素酶。最后,研究了四种稳定剂对于突变型Luc1.2(虫荧光素酶Luc1.1的436位替换为Ala的突变体)的酶活增强作用和催化发光反应的动力学特点改善作用。结果表明,对于Luc1.2的催化反应体系,辅酶A(CoA)、焦磷酸钾(PPiK)、叁磷酸钠(STPP)及5′-叁磷酸肌苷叁钠(ITP)增强发光作用的最适浓度分别为1.0 mmol/L、0.08 mmol/L、1.0 mmol/L、0.8 mmol/L。添加最适浓度的CoA可将突变体Luc1.2催化体系的相对发光强度提高至野生型Luc未添加增强剂反应体系的47.2倍左右,添加最适浓度的STPP可增强至31.6倍左右,PPiK和ITP对Luc1.2催化体系也具有一定的增强相对发光强度的作用。测定添加最适浓度试剂时的虫荧光素酶Luc1.2催化体系的发光体系的动力学特点,结果表明对体系稳定效果最好的为CoA,作用效果为反应开始后15 s内酶活保持80%左右,其他叁种物质STPP、PPiK、ITP可使发光强度在5 s内酶活保持80%左右。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
萤火虫荧光素酶论文参考文献
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