貂源肺炎双球菌和金黄色葡萄球菌的毒力基因检测及其致病性研究

论文摘要

水貂是重要的经济动物之一,已发展形成重要的养殖产业。山东省是水貂养殖第一大省,但是随着集约化、规模化养殖模式的形成,疫病严重妨碍了水貂养殖业的健康发展,造成了很大的经济损失。出血性肺炎是危害水貂的重要疫病之一。近年来,本实验室对水貂出血性肺炎进行了流行病学调查,结果表明,除了绿脓杆菌、克雷伯菌、巴氏杆菌等致病菌外,应该还有其他的病因。为此,本研究对肺炎双球菌（Streptococcus pneumoniae,S.pneumoniae）和金黄色葡萄球菌（Staphyloccocus aureus,S.aureus）在水貂群中的流行情况进行了调查,并对其致病性进行研究,阐明两者在水貂出血性肺炎中的作用。自2017-2018年期间,从山东诸城水貂养殖场采取水貂肺炎病料120份,共分离到2株肺炎双球菌（Sp-1,Sp-2）和3株金黄色葡萄球菌（Sa-6,Sa-16,Sa-24）。采用分子克隆测序技术,分别对所分离的肺炎双球菌的9种毒力基因、金黄色葡萄球菌的17种毒力基因进行检测、分析。结果表明,2株肺炎双球菌均携带ply、nan A、lyt A、psp A、psa A及rrg A基因,Sp-1分离株还携带有pav A,hys A毒力基因,而iga基因均为阴性;3株金黄色葡萄球菌分离株中,Sa-16,Sa-24分离株为耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）,Sa-6分离株为甲氧西林敏感金黄色葡萄球菌（MSSA）,其中MSSA携带pvl基因,3株金黄色葡萄球菌均携带coa、nuc和clf A基因,其中,Sa-6,Sa-24两株同时携带hla、hlb、hld和hlg 4种溶血素基因及Fnbp B毒力基因,肠毒素作为食物中毒病例中重要的致病因素之一,在本研究中只有Sa-6分离株肠毒素seb、seg基因检测为阳性,表皮剥落毒素基因eta、etb及tsst-1均未检出。采用纸片扩散法对5株细菌的耐药性进行了检测,共使用9大类共21种抗生素。本研究中Sp-1,Sp-2分离株对罗红霉素完全耐药,对哌拉西林、头孢噻肟、头孢他啶、头孢西丁、庆大霉素和阿米卡星均敏感。2株MRSA菌株相较于不携带mec A基因的菌株,MRSA菌株对临床上常用的抗生素具有更高程度的耐药性,对青霉素类（氨苄西林、青霉素）和磺胺类（复方新诺明）药物完全耐药,只有部分喹诺酮类（环丙沙星、诺氟沙星）、头孢菌素类（头孢他啶、头孢西丁）药物对Sa-16,Sa-24分离株显示较好的抑菌作用。Sa-6分离株对复方新诺明完全耐药,喹诺酮类、硝基呋喃类、糖肽类及多数头孢菌素类药物均对MSSA分离株显示较好的抑菌作用。根据分离菌株毒力基因检测结果,分别选取肺炎双球菌分离株Sp-1和金黄色葡萄球菌分离株Sa-6进行致病性研究。在小鼠致病性试验中,通过腹腔接种途径对小白鼠进行攻毒试验,结合临床症状观察及小鼠发病时间和死亡率数据统计,结果表明,Sa-6分离株对小鼠的致病性比Sp-1分离株强。之后,回归实验动物,将Sp-1分离株和Sa-6分离株分别通过腹腔接种、肌肉注射和鼻腔接种共3种不同攻毒途径感染水貂。根据感染水貂不同器官中目的菌回收率,并结合组织病理学变化,确定了分离株对水貂具有致病性,同时比较肺炎双球菌和金黄色葡萄球菌经不同途径感染,其对水貂致病性强弱的差异。结果表明:肺炎双球菌分离株经鼻腔感染水貂,病原菌更易通过在鼻咽部的定植,进而从鼻咽部经呼吸道下行,引起肺部感染,而金黄色葡萄球菌分离株则易经破损的皮肤感染水貂,引起水貂化脓性感染、蜂窝织炎等。本研究表明,肺炎双球菌和金黄色葡萄球菌在貂群中存在,并可引起水貂肺炎病征。这一结果丰富了水貂出血性肺炎的研究数据,具有重要的公共卫生学意义和生产实践意义。

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 前言
•   1.1 肺炎双球菌的研究进展
•     1.1.1 病原学
•     1.1.2 致病机理
•     1.1.3 肺炎双球菌毒力因子
•     1.1.4 流行病学
•   1.2 金黄色葡萄球菌的研究进展
•     1.2.1 病原学
•     1.2.2 致病机理
•     1.2.3 金黄色葡萄球菌毒力因子
•     1.2.4 流行病学
•   1.3 本研究的目的与意义
• 2 材料与方法
•   2.1 实验材料
•   2.2 实验仪器
•   2.3 实验试剂
•   2.4 实验方法
•     2.4.1 细菌的分离鉴定
•       2.4.1.1 形态学观察
•       2.4.1.2 革兰氏阳性菌基因组DNA的提取
•       2.4.1.3 细菌 16S r RNA的PCR扩增
•       2.4.1.4 毒力基因检测
•       2.4.1.5 药敏试验
•     2.4.2 小白鼠致病性试验
•       2.4.2.1 菌落形成单位计数
•     2.4.3 水貂致病性实验
•     2.4.4 病理组织学检测
• 3 实验结果
•   3.1 细菌的分离鉴定
•   3.2 毒力基因检测
•   3.3 药敏试验
•   3.4 小鼠致病性试验
•   3.5 水貂致病性实验
•   3.6 病理组织学检测
• 4 分析与讨论
• 5 结论
• 参考文献
• 致谢
• 攻读学位期间发表论文情况

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 商园园

导师: 谢之景

关键词: 肺炎双球菌,金黄色葡萄球菌,毒力基因,耐药性,致病性

来源: 山东农业大学

年度: 2019

分类: 基础科学,农业科技

专业: 生物学,畜牧与动物医学

单位: 山东农业大学

分类号: S852.61

总页数: 63

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