桑花叶型矮缩相关病毒的RepA蛋白在烟草上诱导细胞死亡的机理研究

论文摘要

双生病毒是一类具有孪生颗粒形态的单链环状DNA病毒,广泛分布于全球50多个国家和地区,对番茄、木薯、棉花等多种草本植物造成毁灭性危害。近年来,随着高通量测序技术的发展,研究者们不断地从柑橘、葡萄、桑树和苹果等多种多年生木本植物中检测到了新的双生病毒。由于基因组比较小,编码的遗传信息有限,双生病毒需要依赖与植物复杂的相互作用才能完成复制、转录和移动等生活史。因此,研究双生病毒与植物的互作对于了解植物抵御病毒侵染的机制以及病毒的致病机理具有重要作用。桑花叶型矮缩相关病毒（Mulberry mosaic dwarf-associated virus,MMDaV）是从表现花叶和矮缩的桑树上分离的一种单组份双生病毒。由于生物学特性以及致病机理尚不明确,MMDaV被国际病毒分类委员会划分为双生病毒科的一个暂定种。本论文充分利用研究植物与病毒互作的模式植物——本氏烟,对MMDaV与植物的相互作用开展了以下研究:首先构建了MMDaV的侵染性克隆并将其接种本氏烟,发现MMDaV的侵染性克隆接种3天后在本氏烟上引起了类似过敏性反应的细胞死亡。进一步将MMDaV病毒链上编码的V1、V2、V3、V4和V5以及互补链上编码的C1（RepA）和C2（Rep）构建到含有GFP标签的植物双元表达载体,利用农杆菌介导的瞬时表达方法浸润本氏烟,发现MMDaV编码的RepA的表达在本氏烟上诱导了细胞死亡。为了明确RepA引起细胞死亡的相关功能域,利用生物信息学对RepA的序列和结构域进行了分析,构建了RepA的8个缺失突变体。通过农杆菌介导的瞬时表达试验,发现RepA的RCA motif是RepA在本氏烟上诱导细胞死亡所必需的。进一步利用激光共聚焦显微镜对RepA及其突变体的亚细胞定位进行分析,发现RepA定位于本氏烟表皮细胞的细胞核中,并且RepA的细胞核定位可能与其诱导的细胞死亡有关。在植物中,MAPK级联反应和茉莉酸等信号途径参与了植物对多种病原物的抗性。为了筛选参与RepA诱导的细胞死亡的寄主因子,利用病毒诱导的基因沉默技术对本氏烟中的NDR1、RAR1、COI1、CTR1、NTF6、WRKY1、NPR1和MEK2等8个基因进行沉默,之后在相应基因沉默的烟草上瞬时表达RepA,发现NDR1、RAR1、COI1、CTR1、NTF6、NPR1和MEK2等7个基因的沉默不影响RepA引起的细胞死亡的产生,而WRKY1沉默后抑制了RepA引起的细胞死亡。进一步在WRKY1沉默的植物上接种MMDaV的侵染性克隆,发现WRKY1的沉默也抑制了MMDaV侵染引起的细胞死亡。利用实时荧光定量PCR分析了RepA以及MMDaV接种后WRKY1的基因表达情况,发现RepA的表达或者MMDaV的侵染均显著上调了WRKY1的表达,推测MMDaV的RepA通过激活WRKY1的表达而引起了细胞死亡反应。

论文目录

• 摘要
• abstract
• 英文缩略表
• 第一章 引言
•   1.1 双生病毒
•     1.1.1 双生病毒的危害
•     1.1.2 双生病毒的分类与基因组结构
•     1.1.3 桑花叶型萎缩病病原研究进展
•     1.1.4 双生病毒复制相关蛋白（Rep）的结构与功能
•   1.2 病原物诱导的植物过敏性反应
•     1.2.1 植物的免疫反应
•     1.2.2 病原物侵染诱导的植物过敏性反应
•     1.2.3 双生病毒侵染诱导HR的研究
•     1.2.4 转录因子参与调控植物抗性的相关研究
•   1.3 本研究的目的与意义
• 第二章 MMDaV的 RepA在本氏烟诱导细胞死亡
•   2.1 材料
•     2.1.1 植物材料
•     2.1.2 菌株与抗体
•     2.1.3 试剂与仪器
•   2.2 实验方法
•     2.2.1 植物基因组DNA的提取
•     2.2.2 常规DNA克隆技术
•     2.2.3 基本的连接转化操作
•     2.2.4 根癌农杆菌介导的植物接种
•     2.2.5 MMDaV侵染性克隆的构建
•     2.2.6 MMDaV ORF瞬时表达载体的构建
•     2.2.7 病毒的侵染性检测
•     2.2.8 植物蛋白质相关技术
•     2.2.9 DAB染色
•     2.2.10 电子渗漏试验
•   2.3 结果与分析
•     2.3.1 MMDaV侵染性克隆的构建和致病性测定
•     2.3.2 RepA接种本氏烟会诱导细胞死亡
•     2.3.3 RepA的亚细胞定位
•   2.4 小结与讨论
• 第三章 RepA诱导细胞死亡的功能域分析
•   3.1 材料
•   3.2 实验方法
•     3.2.1 植物基因组DNA的提取
•     3.2.2 常规DNA克隆技术
•     3.2.3 基本的连接转化操作
•     3.2.4 反向PCR定点诱变技术
•     3.2.5 根癌农杆菌介导的植物接种
•     3.2.6 植物蛋白质相关技术
•     3.2.7 DAB染色
•     3.2.8 RepA突变体瞬时表达载体的构建
•   3.3 结果与分析
•     3.3.1 RepA诱导HR的功能域鉴定
•     3.3.2 RepA突变体的亚细胞定位
•     3.3.3 细胞核定位可能是RepA诱导HR所必需的
•   3.4 小结与讨论
• 第四章 与RepA诱导细胞死亡相关的寄主因子的筛选
•   4.1 材料
•   4.2 实验方法
•     4.2.1 常规DNA克隆技术
•     4.2.2 基本的连接转化操作
•     4.2.3 植物RNA的提取
•     4.2.4 病毒诱导的基因沉默载体的构建
•     4.2.5 根癌农杆菌介导的植物接种
•     4.2.6 Real-time RT-PCR检测基因的沉默效率和表达情况
•     4.2.7 植物蛋白质相关技术
•   4.3 结果与分析
•     4.3.1 与RepA诱导细胞死亡相关的寄主因子的筛选
•     4.3.2 WRKY1 参与MMDaV诱导的细胞死亡
•     4.3.3 MMDaV以及RepA上调WRKY1 的表达
•   4.4 小结与讨论
• 第五章 全文结论
• 附录 胜红蓟上一种与双生病毒伴随的重组β卫星分子的鉴定
•   1.1 材料
•     1.1.1 植物材料
•     1.1.2 菌株
•     1.1.3 试剂与溶液
•     1.1.4 试验仪器
•   1.2 实验方法
•     1.2.1 植物基因组DNA的提取
•     1.2.2 常规DNA克隆技术
•     1.2.3 基本的连接转化操作
•     1.2.4 病毒DNA-A及其beta卫星的基因组结构和进化重组分析
•   1.3 实验结果
•     1.3.1 病毒DNA-A的基因组扩增及结构分析
•     1.3.2 病毒DNA-A的进化和重组分析
•     1.3.3 Beta卫星的基因组扩增及结构分析
•     1.3.4 Beta卫星的进化和重组分析
•   1.4 小结与讨论
• 参考文献
• 致谢
• 作者简历

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 孙少双

导师: 周雪平

关键词: 桑花叶型矮缩相关病毒,细胞死亡

来源: 中国农业科学院

年度: 2019

分类: 基础科学,农业科技

专业: 生物学,植物保护

单位: 中国农业科学院

分类号: S432.41

总页数: 77

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